婴幼儿配方奶粉中丁酸、己酸、辛酸、癸酸的测定方法验证

崔承远

北大荒完达山乳业股份有限公司，黑龙江哈尔滨 150078

0 引言

丁酸是一种短链饱和脂肪酸，其最大功能是供应能量，而聚集在脂细胞内形成脂肪的很少，具有参与基因调控调节免疫应答和炎症反应，抑制肿瘤生长，促进细胞分化和凋亡的作用。己酸（俗称羊油酸）、辛酸（俗称羊脂酸）、癸酸（俗称羊蜡酸）三种饱和脂肪酸具有相似的生物活性。辛酸和癸酸都具有抗病毒的生物活性。癸酸与甘油三酯生成的癸酸单酰甘油酯具有抗艾滋病毒的功能[1～3]。

奶粉中天然含有丁酸、己酸、辛酸和癸酸，虽然不属于婴幼儿配方奶粉中常规考核及检测项目，但其对于婴幼儿成长同样起到了一定的积极作用，因此，对丁酸、己酸、辛酸和癸酸的检测以及针对检测方法进行方法验证[4～7]具有必要性。

1 试剂与方法

1.1 试剂

乙酰氯（C2H3ClO）：色谱纯；甲醇（CH3OH）：色谱纯；甲苯（C7H8）：色谱纯；无水碳酸钠（Na2CO3）：分析纯。

1.2 溶液配制

1.2.1 乙酰氯-甲醇溶液（10.00%）

向100.0 mL容量瓶内加入约40.0 mL甲醇，并将盛装有甲醇的容量瓶置于冷水中，再吸取乙酰氯10.0 mL，并逐滴缓慢加入到容量瓶内，待溶液恢复至室温后取出容量瓶，以甲醇定容至刻度线，混匀，此为浓度10.00%的乙酰氯-甲醇溶液。

1.2.2 碳酸钠溶液（60 g/L）

称取无水碳酸钠60 g于1 000.0 mL容量瓶内，加入约600.0 mL超纯水，超声震荡至无水碳酸钠完全溶解，再以超纯水定容至刻度线，混匀，此为浓度60 g/L的碳酸钠溶液。

1.3 仪器设备及参数

1.3.1 仪器设备

气相色谱仪（配置有FID氢火焰离子检测器）；分析天平：感量0.1 mg；离心机：转速≥5 000 r/min；38.0 mL带有聚四氟乙烯内垫的螺纹帽试管；恒温磁力搅拌器；涡旋振荡器。

1.3.2 仪器参数

毛细管色谱柱：DB-23型，柱长30 m，内径0.25 mm，膜厚0.25 μm；进样口温度：250 ℃；检测器温度：260 ℃；载气：高纯氮气，纯度99.999%，流速1.0 mL/min；分流比：20∶1；辅助气体：氢气45.0 mL/min，空气450.0 mL/min；进样体积：1 μL/min；

1.3.3 程序升温

丁酸、己酸、辛酸和癸酸程序升温见表1。

表1 丁酸、己酸、辛酸和癸酸程序升温

1.4 分析步骤

1.4.1 试样处理

称取婴幼儿配方奶粉试样0.5 g（精确至0.001 g）于38.0 mL螺口玻璃管中，加入5.0 mL甲苯和6.0 mL 10.00%的乙酰氯-甲醇溶液，充氮气后，旋紧螺纹盖。振荡混合后于（80±1）℃水浴中放置2 h，期间每隔20 min取出振摇1 次，水浴后取出冷却至室温。

将甲酯化衍生反应后的样液转移至50.0 mL离心管内，分别用3.0 mL碳酸钠溶液清洗玻璃管3 次。将螺纹管内溶液全部转移至50.0 mL离心管中，混匀。以5 000 r/min的转速离心5 min。取出上清液作为脂肪酸测试样液，气相色谱仪分析测定。

1.4.2 标准溶液测试

（1）丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合标准物质储备液

分别称取丁酸甘油三酯标准物质、己酸甘油三酯标准物质、辛酸甘油三酯标准物质和癸酸甘油三酯标准物质各100 mg于同1 支100.0 mL容量瓶中，以甲苯定容至刻度线，此为丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合标准物质中间液。

（2）丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合标准物质工作液

吸取上述四种组分标准物质储备液5.0 mL于38.0 mL螺口玻璃管内，加入6.0 mL 10.00%的乙酰氯-甲醇溶液，后续操作按照1.4.1中的操作步骤进行。甲酯化衍生结束后，从上清液中吸取4.0 mL于10.0 mL容量瓶内，以甲苯定容至刻度线，即为丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合标准物质工作液。

1.4.3 试样溶液的测定

相同条件下，将样品溶液和标准物质工作液分别引入气相色谱仪进行测定。试样中各脂肪酸含量按公式（1）进行计算。

式中：Xi为试样中各脂肪酸的含量，单位为克每百克（g/100 g）；Ai为试样测定液中各脂肪酸甲酯的峰面积；msi为在标准测定液的制备中吸取的脂肪酸甘油三酯标准工作液中所含有的标准品的质量，单位为毫克（mg）；FTG-FAi为各脂肪酸甘油三酯转化为脂肪酸的换算系数；ASi为标准测定液中各脂肪酸的峰面积；m为试样的称样质量，单位为毫克（mg）；100为将含量转换为每100 g试样中含量的系数。计算结果保留3 位有效数字。

2 结果与分析

2.1 标准物质溶液测定

分别称取丁酸甘油三酯标准物质105.90 mg、己酸甘油三酯83.80 mg、辛酸甘油三酯82.11 mg、癸酸甘油三酯82.10 mg于同一只100.0 mL容量瓶内，以甲苯定容至刻度线，此为丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合标准物质储备液。

吸取上述四种组分混合标准物质储备液5.0 mL于38.0 mL螺口玻璃管内，加入6.0 mL 10.00%的乙酰氯-甲醇溶液，后续操作按照1.4.1中的操作步骤进行。甲酯化衍生结束后，从上清液中吸取4.0 mL于10.0 mL容量瓶内，以甲苯定容至刻度线，即为丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合标准物质工作液。

丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯标准物质储备液、工作液浓度详见表2。

表2 丁酸、己酸、辛酸和癸酸混合标准物质储备液、工作液浓度

将丁酸、己酸、辛酸和癸酸混合标准物质工作液连续运行6 次，得到6 次运行图谱及各组分响应值（峰面积），并分别计算每个组分响应值（峰面积）的标准偏差，如表3所示。

表3 丁酸、己酸、辛酸和癸酸混合标准物质工作液各组分响应值（峰面积）及RSD

2.2 方法检出限与定量限

采用空白标准偏差法，选择婴幼儿配方奶粉样品作为试验对象，称取40 份，每份0.5 g，按照1.4.1中的操作步骤对试样进行前处理。对处理结束后的试样样液分别进行50.0 倍稀释、50.0 倍稀释、100.0倍稀释和50.0 倍稀释。其中50.0 倍稀释样液用于丁酸方法检出限的测定、50.0 倍稀释样液用于己酸方法检出限的测定、100 倍稀释样液用于辛酸方法检出限的测定、50.0 倍稀释样液用于癸酸方法检出限的测定。

将上述样液分别通过气相色谱仪进行检测分析，得出4 种组分的样品图片及相关参数，进而计算出4 种组分的方法检出限及定量限，如表4～7所示。

2.3 精密度

选择婴幼儿配方奶粉样品作为试验对象，进行10组平行试验[8]，按照上述1.4.1中的描述进行试样前处理和测定，得出10 组试验结果，如表8～11所示。

表8 辛酸正确度试验加标体积、加标质量及甲苯补充体积

2.4 正确度

结合上述精密度试验中所得到的婴幼儿配方奶粉试样中4 种组分的含量数值，并以此作为本底，分别进行4 种组分的加标回收率试验（即正确度试验）[9]。加标原则分为低、中、高3 个浓度水平，其中低浓度水平为以本底数值的0.8 倍进行标准物质添加、中浓度水平为以本底数值的1.0 倍进行标准物质添加、高浓度水平为以本底数值的1.2 倍进行标准物质添加，每个浓度水平分别进行6 组平行试验。各组加标回收率试验标准物质溶液添加体积及甲苯补充体积详见表6～27。

表6 丁酸正确度试验加标体积、加标质量及甲苯补充体积

丁酸、己酸、辛酸、癸酸低浓度加标回收率（正确度）实验结果如表10所示。

表10 丁酸、己酸、辛酸、癸酸低浓度加标回收率（正确度）结果

丁酸、己酸、辛酸、癸酸中浓度加标回收率（正确度）实验结果如表11所示。

表11 丁酸、己酸、辛酸、癸酸中浓度加标回收率（正确度）结果

丁酸、己酸、辛酸、癸酸高浓度加标回收率（正确度）实验结果如表12所示。

表 4 丁酸、己酸、辛酸、癸酸方法检出限与定量限结果 单位：mg/100 g

表5 丁酸、己酸、辛酸、癸酸精密度试验结果

表7 己酸正确度试验加标体积、加标质量及甲苯补充体积

表12 丁酸、己酸、辛酸、癸酸高浓度加标回收率（正确度）结果

3 结论

经方法检出限、精密度和正确度方法特性参数的验证，得出丁酸方法检出限为0.608 mg/100 g，方法定量限为1.820 mg/100 g；己酸方法检出限为0.276 mg/100 g，方法定量限为0.827 mg/100 g；辛酸方法检出限为0.323 mg/100 g，方法定量限为0.969 mg/100 g；癸酸方法检出限为0.801 mg/100 g，方法定量限为2.400 mg/100 g。对比《GB 5009.168—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》中各组分定量限数值，丁酸3.300 mg/100 g、己酸3.300 mg/100 g、辛酸3.300 mg/100 g、癸酸3.300 mg/100 g。本次试验4 种组分方法定量限数值均低于标准中所给数值，符合要求。丁酸方法精密度为1.95%，己酸方法精密度为1.87%，辛酸方法精密度为1.67%，癸酸方法精密度为1.58%，均满足《GB 5009.168—2016 食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》中对于精密度不大于10.00%的要求；丁酸3水平6平行共计18 组正确度试验加标回收率在95.70%～105.00%范围内，己酸3水平6平行共计18 组正确度试验加标回收率在95.90%～104.00%范围内，辛酸3水平6平行共计18 组正确度试验加标回收率在95.50%～104.00%范围内，癸酸3水平6平行共计18 组正确度试验加标回收率在95.10%～104.00%范围内，均满足《GB/T 27417—2017 合格评定 化学分析方法确认和验证指南附录A》的要求[10]。

表9 癸酸正确度试验加标体积、加标质量及甲苯补充体积