固相萃取LC-MS/MS法分析海洛因及其代谢产物在过量注射致死家兔体内的分布

张 松，徐 翩，王丽丽

（重庆市公安局a.物证鉴定中心，重庆400147；b.九龙坡区分局，重庆400039）

目前，药物滥用已成为全球性公害，其中麻醉药品成瘾特别是海洛因成瘾是一个世界性难题，吸毒者以青少年居多，男性远高于女性。毒品的猖獗蔓延，使很多误入歧途的染毒者陷入痛苦的深渊不能自拔，吸毒者精神变态，意志削弱，对性病、艾滋病的易感染率明显升高，使其健康遭到毁灭性的损害，寿命缩短（平均寿命小于40岁）。阿片类药物的依赖性具有耐受性、精神依赖性和身体依赖性三方面的明显特征。其戒断后的痛苦体验是一种负性强化作用，是产生强迫用药行为的内在驱动力。产生依赖性后，一旦中断用药会出现严重的戒断症状。戒断症状一般在最后一次服药后几小时内（约6小时）出现，表现为焦虑不安、打哈欠、流涕、恶心呕吐、寒战、全身痛觉过敏、肌肉抽搐、起鸡皮疙瘩、失眠、病人完全不能入睡，服用安眠药无效。病人在停药后均出现程度不同的短暂意识障碍，表现为嗜睡，重者出现短暂谵妄状态，一般在停药24～26小时较为突出，历时2～3天后便显著减轻，危害性极大。海洛因的常见吸食途径有：鼻吸、抽吸，皮下注射和静脉注射等。吸食海洛因不仅会造成慢性中毒（成瘾），而且吸食过量还会引起急性中毒甚至死亡。近年来随着有关海洛因中毒死亡案例的增多[1]，逐渐引起了广大检验鉴定工作者的重视。

本实验的目的是建立静脉过量注射致死家兔模型，研究海洛因及其代谢产物在过量注射致死家兔体内的分布，为静脉过量注射海洛因死亡案例的检材提取、毒理学检验提供依据。

1 材料

1.1 试剂和材料

海洛因（纯度为99.9%）、盐酸海洛因标准品、盐酸吗啡（Mor）标准品、单乙酰吗啡（Acm）标准品、葡萄糖醛酸吗啡（M3G）、氘代葡萄糖醛酸吗啡（M3G-D3）标准品均由公安部物证鉴定中心提供；Clean Screen DAU混合阳离子交换柱（CSDAUL柱）由北京捷安捷公司提供。

1.2 仪器与分析条件

美国ABI API2000LC/MS/MS（液相色谱–串级四极杆质谱联用仪），ESI离子源。岛津LC-20A高效液相色谱仪。Caliper Rapid Trace固相萃取仪。

数据处理系统：Analyst 1.4.1分析软件。

1.3 实验动物

家兔6只，均为雄性，体重2.5 kg±0.2 kg（第三军医大学动物实验中心提供），实验前隔夜禁食。

2 方法

2.1 动物模型建立

家兔6只（其中1只为空白对照），将家兔仰卧位捆绑固定于解剖台上，经耳缘静脉注射纯度为99.9%的海洛因100 mg（用5 mL生理盐水溶解，三分钟注射完毕），观察家兔中毒症状。家兔死亡后立即解剖取心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、心血、尿液、玻璃体液。样品立即用所建立的固相萃取方法进行提取、液质联用仪检验。空白对照家兔经耳缘静脉注射5 mL生理盐水。

2.2 样品的提取

取血、尿、玻璃体液等液体检材各0.5 mL，加含100 ng/mL M3G-D3的水溶液1.5 mL稀释，离心，取上清液待过柱；取心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉等固体匀浆检材各0.5 g，加含100 ng/mL M3G-D3的水溶液1.5 mL稀释，离心，取上清液待过柱。

取CSDAUL混合阳离子交换柱，加1 mL甲醇，1 mL水活化，上清液过柱，1 mL水清洗，2 mL甲醇洗脱，挥干，用0.5 mL初始流动相溶解，待检。

2.3 统计方法

采用Excel统计软件处理数据，结果以均数表示。

3 结果与讨论

3.1 工作曲线

分别取空白家兔血（代表液体检材）、肝脏匀浆（代表固体检材）添加M3G和Mor的标准品配制成含M3G和Mor各0.01、0.05、0.10、0.50、2.00、10.00、100.00μg/mL的系列样品，取空白家兔血（代表液体检材）、肝脏匀浆（代表固体检材）添加Acm标准品，配制成含Acm各0.01、0.05、0.10、0.50、2.00、10.00、100.00μg/mL的系列样品，按照2.2方法进行样品制备，按所建仪器方法进行检测，以Mor、Acm和M3G的浓度为横坐标（X），以其峰面积与内标物峰面积的比为纵坐标（Y）进行线性回归。测定结果见表1。

表1 血液和肝脏中各组分的工作曲线

3.2海洛因及其代谢产物在过量注射致死家兔体内的分布（见表2，图1）

表2 组织脏器中各组分含量

图1 海洛因代谢产物在家兔体内分布图

3.3 讨论

（1）注射大剂量海洛因后5只家兔均在5分钟内死亡，中毒症状表现为：由心跳加速、呼吸急促、四肢痉挛、瞳孔缩小，变为心跳呼吸缓慢、四肢松软最后死亡，这种症状与吸毒人员过量注射海洛因致死案例症状相同[2]。

（2）由表2、图1结果可见，致死家兔体内海洛因代谢产物呈一定规律分布，心血和肺组织中吗啡含量较高，结合态吗啡含量很少，这是因为海洛因注射致死的原因为呼吸抑制，缺血缺氧、二氧化碳潴留使血液和肺组织呈弱酸性，致使吗啡大部分保持在游离状态[3-7]。肝组织和肾组织中含结合态吗啡较多，是因为两者是药物转化和排泄的主要器官[8-9]，肾组织中含结合态吗啡较多证明了吗啡主要是以葡萄糖醛酸结合态形式排泄的。以上结果提示，在实际案件中心血、肝组织、肾组织、肺组织都是很好的检材。

脑组织中检出吗啡2.96μg/g以及少量海洛因，未检出葡萄糖醛酸结合态吗啡，可能是由于血脑屏障的保护作用和脑内的酸性环境使吗啡呈游离状态。

（3）其他组织中均检出海洛因及其代谢产物，但是吗啡和葡萄糖醛酸结合态吗啡含量均较少，可能是由于注射剂量过大，药物来不及分布完全就发生死亡。

本实验建立了静脉过量注射致死家兔模型，研究了急性中毒死亡当时海洛因及其代谢物的分布情况，为静脉过量注射海洛因死亡案例的检材提取、毒理学检验提供了依据。同时，为以后研究尸体中出现的死后再分布[11]（Postmortem Redistribution，PMR）打下了基础。