脱除SPVD甘薯组培苗快繁及移栽研究

袁 蕊，唐 伟，孙书军，赵路宽，胡 杨，马居奎，王 洁，曹清河，周志林

（江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，江苏徐州 221131）

甘薯（Ipomoea batatas Lam.），是我国重要的粮食、经济和能源作物，具有稳产、高产、适应性好、抗逆性强等特点。甘薯块根中含有大量的淀粉、可溶性糖，少量的蛋白质、维生素、纤维素等，在身体健康和疾病预防方面有重要作用，甘薯既可以作为人类的粮食和蔬菜，又能作为工业原料和饲料[1-2]。我国是世界上最大的甘薯生产国，每年种植面积近460 万hm2，占世界甘薯种植面积的50%以上，鲜薯总产量1 亿t，占世界甘薯总产量的80%左右[3]。

甘薯主要依靠无性繁殖，在长期的栽培过程中常因病毒的感染而退化，导致产量和品质严重受损。由甘薯羽状斑驳病毒（sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）协生共侵染引起的甘薯病毒病（SPVD）对甘薯产量影响极大，可造成90%以上的产量损失，甚至绝收[4]。茎尖脱毒是应对甘薯病毒病的主要措施，生产优质脱毒的组培苗是甘薯产业健康可持续发展的重要保障[5]。脱毒后的甘薯能恢复品种原始的优良性状，采用快速繁殖技术将甘薯这些优良品质遗传下去，可达到提高甘薯产量和质量的目的[6]。但由于品种间的特异性，不同品种的脱毒快繁方法存在差异，一种合理的快速繁殖方式不仅可以节约大量的成本，还能大幅缩减脱毒甘薯种苗投入实际生产需要的时间[7]。此外，甘薯脱毒组培苗的移栽驯化是甘薯离体繁殖程序中的关键步骤，组培苗移栽成活率低，会造成生产成本大幅度上升[8]，因此，组培苗移栽质量和成活率也会影响在生产上的推广。

前人对甘薯脱毒培养研究较多[9-12]，但是针对近年来SPFMV 和SPCSV 引起的SPVD 研究较少，并且普遍反映甘薯感染SPVD 后难以脱除[13]。因此，针对脱除SPVD 甘薯组培苗培养、脱毒组培苗快繁及移栽技术，本试验利用茎尖分生组织培养和不同病毒抑制剂预处理相结合的方法探究SPVD 脱除效率，并通过添加不同浓度的NAA、6-BA，筛选最适快繁培养基激素组合，同时分析不同继代培养时间和是否炼苗对脱毒组培苗移栽成活率影响，以期为甘薯脱毒种苗在生产中的应用提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 供试材料

感染SPVD 的徐薯22 和阜徐薯20 病株，均来自江苏徐淮地区徐州农业科学研究所甘薯抗病鉴定圃。

1.2 供试试剂

MS 培养基（不含琼脂和蔗糖，海博生物）、蔗糖（分析纯，沪试SCR）、琼脂粉（Biotopped）、NAA（常熟市福山生化试剂厂）、6-BA（上海宇涵生物科技有限公司），M-MLV、PCRmix 均购自takara 北京生物技术有限公司。试验用不同病毒抑制剂种类及浓度见表1。

表1 不同病毒抑制剂

1.3 试验方法

1.3.1 脱除SPVD 甘薯组培苗培养 取感病材料外植体清洗干净，置超净工作台消毒，解剖镜下切取带1～2 个叶原基的茎尖分生组织[14]，产生愈伤组织后经培养、分化出苗、株系分离，参考乔奇等[15]的方法对甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）检测，分别计算脱除率

对检测出病毒的组培苗，在完成第1 次茎尖脱毒后再次进行剥尖培养，完成第2 次茎尖脱毒，重新进行病毒检测。选出脱毒组培苗培养、繁殖供后续试验用。本试验培养基为4.4 g/L MS 培养基+30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂粉+0.01 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，定容到1 L，调节pH 值到5.8～6.0。

1.3.2 病毒抑制剂结合茎尖分生组织培养 取感病材料，按表1 配制不同病毒抑制剂的水溶液，水培72 h，对照（CK）为水，按1.3.1 步骤进行茎尖分生组织培养及病毒检测。

1.3.3 不同浓度NAA+6-BA 组合对组培苗株高的影响 取徐薯22 和阜徐薯20 脱毒组培苗，分别接种在添加有不同浓度NAA 和6-BA 组合的培养基上，30 d 后调查株高。培养条件：（28±2）℃，日光灯冷光源强度为33 μmol/（m2·s），每天光照9 h，暗培养15 h。

本试验培养基为MS+B5 有机物（10 mg/L VB1、10 mg/L VB6、10 mg/L 烟酸、10 mg/L 肌醇）+30 g/L蔗糖+9 g/L 琼脂粉，定容到1 L，调节pH 值到5.8～6.0。

1.3.4 移栽试验 徐薯22 和阜徐薯20 脱毒组培苗，在不添加植物生长调节剂的MS 培养基上，继代培养（20、30、40、50、60 d）后分别移栽，移栽用基质为草炭土∶蛭石∶珍珠岩=5∶4∶1，加0.5 g/L 枯草芽孢杆菌水溶液混匀。炼苗驯化是在组培苗移栽前在室内松开培养瓶瓶口再培养3 d，然后进行移栽；不炼苗是直接移栽到基质，每个处理4 个重复。移栽7 d后，计算成活率

1.3.5 数据处理 数据整理及分析使用Microsoft Excel 2007 软件，相关性及显著性分析采用软件DPS 15.0。

2 结果与分析

2.1 茎尖分生组织培养对甘薯苗SPVD 的脱除效果

由表2 可知，感病材料徐薯22 和阜徐薯20，通过一次茎尖分生组织培养，SPCSV 的脱除率均达到100%，SPFMV 的脱除率分别是90.00%和53.33%；通过二次茎尖分生组织培养，徐薯22 和阜徐薯20 的SPCSV 和SPFMV 脱除率均为100%。所以经二次茎尖分生组织培养能完全脱除SPFMV和SPCSV。

表2 不同茎尖分生组织培养次数对甘薯SPVD 脱除率的影响 单位：%

2.2 不同病毒抑制剂结合茎尖分生组织培养对SPFMV 脱除率和成苗率的影响

通过不同病毒抑制剂水培72 h 后进行常规茎尖分生组织培养，对成苗进行SPFMV 检测，结果见表3。徐薯22 成苗率最高的是对照（43.33%），SPFMV 脱除率最高的是宁南·嘧肽（100%），这两组抑制剂成苗率较其他抑制剂有显著性差异（P＜0.05）；阜徐薯20 成苗率和SPFMV 脱除率最高的均为宁南·嘧肽处理，分别为46.67%和90%，说明宁南·嘧肽的预处理有助于茎尖分生组织培养SPFMV的脱除。

表3 不同病毒抑制剂对甘薯SPFMV 茎尖成苗率和脱除率的影响 单位：%

2.3 不同浓度NAA+6-BA 组合对组培苗株高的影响

统计徐薯22 和阜徐薯20 脱毒组培苗接种在不同浓度NAA+6-BA 组合培养基上的株高，结果发现，徐薯22 在A4 处理（0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA）培养基上株高最高，达到了11.58 cm，显著（P＜0.05）高于其他组合；而阜徐薯20 在A5 处理（0.01 mg/L NAA+6-BA 1.0 mg/L）培养基上株高最高，达到了10.00 cm，显著（P＜0.05）高于其他组合（表4）。

表4 不同浓度NAA+6-BA 组合对甘薯组培苗株高的影响

2.4 炼苗对组培苗移栽成活率的影响

由表5 可知，徐薯22 和阜徐薯20 组培苗的成活率在炼苗处理中，随着继代培养时间的增加逐渐升高，培养60 d 时成活率最高，分别为86.67%和83.33%；在不炼苗处理中，徐薯22 和阜徐薯20 组培苗培养30 d 时成活率最高分别为75.00%和80.00%。徐薯22 组培苗在培养20 d 和30 d 炼苗成活率显著小于不炼苗（P＜0.05），在培养40 d 炼苗和不炼苗成活率相等，在培养50 d 和60 d 炼苗成活率显著大于不炼苗（P＜0.05）；阜徐薯20 组培苗在培养20、30 和40 d炼苗成活率均显著小于不炼苗（P＜0.05），在培养60 d炼苗成活率显著大于不炼苗（P＜0.05）。

表5 炼苗对组培苗移栽成活率的影响

2.5 组培苗成活率与继代培养时间、炼苗处理相关性分析

组培苗成活率与继代培养时间、炼苗处理相关性分析见表6。不同继代培养时间对组培苗移栽成活率的相关性不显著，这有利于节约时间成本；是否炼苗对不同基质快繁苗移栽成活率有极显著影响，在实际应用中可选择最优的炼苗处理和培养时间。

表6 组培苗成活率与继代培养时间、炼苗处理相关性分析

3 讨论与结论

病毒在植株中通过胞间连丝实现细胞到细胞间的移动，再通过营养物质流动实现长距离移动，由于茎尖特殊表达机制，抑制了病毒在茎尖的传递和复制，使其不能到达可存活的组织，茎尖脱毒是应对甘薯病毒病的主要措施[16]。研究表明，利用甘薯茎尖分生组织培养的脱毒苗能较好地恢复品种的优良性状，比未经脱毒的植株增产30%～50%[17]。本试验以感染SPVD 的徐薯22 和阜徐薯20 为材料，进行茎尖剥离，结果发现一次茎尖分生组织培养对SPCSV 脱除率为100%，SPFMV 需要二次剥尖，二次茎尖分生组织培养对感病甘薯的脱毒组培苗培养是必要的。

病毒抑制剂对植物病毒脱毒效果的研究，在大白菜[18]、蝴蝶兰[19]等植物病毒脱毒中已有应用，适宜的病毒抑制剂对植物病毒脱除有增效作用。试验用4 种不同病毒抑制剂预处理结合茎尖分生组织培养，探究对感病材料SPFMV 的脱除效果，本试验在预试验阶段发现甘薯苗在水培第4 天时，部分甘薯叶片出现异样（叶片略显增厚且颜色加深或叶片变黄），所以选用水培72 h。结果表明，病毒抑制剂宁南·嘧肽处理组对供试材料适用效果最好，对阜徐薯20 的病毒脱除增效明显。

在植物生长过程中，植物激素在植物组织生长、发育、器官分化中起到了重要的作用，植物生长调节剂是合成植物激素，可以调节植物的代谢和生理功能[20-21]。在组织培养中，植物生长调节剂的种类和浓度是影响组培苗诱导分化及生长的重要因素[22]。本试验结果表明，徐薯22 最适快繁植物生长调节剂组合是A4 处理（0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA），而A5 处理（0.01 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA）是阜徐薯20 最适快繁植物生长调节剂组合，这与周志林等[23]对不同蔓长特性甘薯品种的快繁最佳培养基为添加NAA/6BA 分别0.01～0.05 mg/L 和1.0 mg/L MS 培养基的研究结果相对一致。

由于组培苗组织分化不完善、光合自养能力弱、适应性差、气孔多且不易关闭、叶绿素少、根毛少，一般在高湿、弱光、恒温下异养培养。而通过炼苗过程逐步改变其生长条件逐步促使其组织发育完全，以适应外界环境，提高对环境的适应能力[24]。不同培养时间，炼苗对快繁苗移栽成活率影响不同，培养时间越长经过炼苗移栽成活率越高。但是本试验在培养20～40 d 的供试材料组培苗中，不炼苗的移栽成活率显著高于炼苗，尤其在继代培养30 d，不炼苗直接移栽成活率也可达75.00%～80.00%，所以实际生产中可根据需求选择是否炼苗确定移栽时间。

本试验中，二次茎尖分生组织培养可完全脱除由SPFMV 和SPCSV 协生共侵染引起的SPVD，不同病毒抑制剂结合茎尖分生组织培养对不同品种甘薯的SPFMV 脱除效果有差异，脱毒组培苗快繁的最佳植物生长调节剂组合为0.01～0.05 mg/L NAA 和1.0 mg/L 6-BA，炼苗能显著提高组培苗移栽成活率，但继代培养30 d 不炼苗移栽可能是今后脱毒试管苗高效快速产业化应用需关注的一个方向。