赤霉病抗性基因Fhb1和Fhb7在江苏省淮北小麦新品系中的分布研究

张善磊，王卫军，吕春华，刘晓飞，赖尚科，崔小平

（江苏省农业科学院宿迁农科所，江苏宿迁 223800）

小麦赤霉病（fusarium head blight，FHB）是由禾谷镰刀菌［Fusarium graminearum Schwabe.，有性态Gibberella zeae（Schwein.）Petch］等多种镰刀菌引起的小麦真菌性病害，给世界小麦生产和粮食安全造成严重威胁[1-3]。此外，随着小麦籽粒灌浆成熟，赤霉病菌产生脱氧雪腐镰孢菌烯醇（deoxynivalenol，DON），雪腐镰孢菌烯醇（nivalenol，NIV），玉米赤霉烯酮（zearalenol，ZEN）等多种毒素，导致病粒带毒，为害人畜健康[1]。

江苏淮北地处黄淮地区，主要种植半冬性小麦，常年种植面积1.3×106hm2左右，占粮食作物的40%，是全省小麦的主产区和高产区，对保障江苏省粮食安全举足轻重[4]。近年来，该区域连年出现局部地区赤霉病重发、流行的现象，2010年、2012年和2015年发生尤为严重[5-7]。据统计，上述3年的发病面积均占种植面积的1/3 以上，对小麦的高产稳产构成严重威胁。随着小麦基因组学研究的深入和分子标记技术的发展，迄今至少有100 个抗赤霉病位点被报道，抗病基因Fhb1 和Fhb7 已被成功克隆并开发出诊断性分子标记，为利用分子标记辅助选择育种技术、快速培育抗性品种防治病害的发生流行提供了可能[8-11]。

Fhb1 是位于小麦3B 染色体短臂上的一个赤霉病主效抗病基因，抗性强且稳定。徐婷婷等[12]研究发现，含有Fhb1 抗病基因及其基因组合的品种（系）具有较低的病情指数；张宏军等[13]研究发现，含有Fhb1 基因家系的平均病情指数较不含有Fhb1 基因家系低4.0；蒋正宁等[14]研究发现，含有Fhb1 抗病等位基因的品种（系），病小穗数显著低于感病等位基因品种，证明该基因与赤霉病抗性相关，具有重要育种价值。Fhb7 是来源于小麦近缘植物长穗偃麦草的一个抗病基因。KIM 等[15]对小麦-长穗偃麦草的7el2-7D 代换系进行鉴定，发现该基因高抗赤霉病；GUO 等[16]和ZHANG 等[17]研究发现，含有Fhb7 抗病基因材料的平均病小穗数较感病材料低，可解释赤霉病抗性表型的30.46%；WANG 等[11]研究发现，不同遗传背景的小麦品种中导入Fhb7 基因能同时提高对赤霉病和茎基腐病的抗性水平，具有广谱解毒功能，且不影响产量。如果它们在半冬性小麦抗赤霉病育种中加以利用，将大大提高抗性品种选育效率。本研究利用赤霉病抗性基因Fhb1 的诊断性标记和Fhb7 的显性标记，对155 份小麦新品系进行基因型检测，旨在明确其在江苏省淮北小麦中的分布情况，为进一步扩大使用这些抗性基因，选育新的抗赤霉病小麦品种提供有益信息。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试材料包括2017—2020年江苏省淮北小麦预备试验新品系155 份，2017—2018年度61 份、2018—2019年48 份、2019—2020年度46 份。携带赤霉病抗性基因Fhb1 的苏麦3 号由江苏省农业科学院粮食作物研究所提供，望水白由江苏省农业种质资源保护和利用平台提供。所有供试材料种植于江苏省农业科学院宿迁农科所泗阳试验基地，常规栽培方式管理。

1.2 小麦基因组DNA 提取和引物合成

小麦分蘖盛期采集不同材料的新鲜叶片，采用CTAB 法提取基因组DNA[18]，使用核酸分析仪检测DNA 提取质量。利用朱展望等[10]设计的小麦赤霉病主效抗性基因Fhb1 的诊断性分子标记His3B-4 和WANG 等[11]设计的小麦赤霉病主效抗性基因Fhb7的显性分子标记，对155 份江苏省淮北小麦新品系进行基因型检测，引物序列和目标扩增片段大小见表1。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 用于赤霉病抗性基因检测的引物

1.3 PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳

20 μL 的PCR 反应总体系包含：ddH2O 14.4 μL，模板DNA（10 ng/μL）2.0 μL，10×Buffer（25.0 mmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.4 μL，正反向引物（10.0 μmol/L）各0.4 μL，Taq DNA 聚合酶（2.0 U/μL）0.4 μL。PCR 扩增反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58～65 ℃复性30 s，72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃延伸10 min。反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离，DuRed 核酸燃料染色后，在紫外凝胶成像仪上观察记载。

2 结果与分析

2.1 抗性基因Fhb1 和Fhb7 的分子检测

利用小麦赤霉病抗性基因Fhb1 和Fhb7 的分子标记，对155 份江苏淮北小麦新品系进行基因型检测，Fhb1 基因标记在含有抗病等位基因的材料中能扩增出1 309 bp 左右的预期条带，此外其他带型为fhb1 感病等位基因型（图1a、表2）；Fhb7 基因标记为显性标记，该标记在含有抗病等位基因的材料中能扩增出892 bp 的预期条带，而在不含有该基因的材料中无此带型，记为fhb7 感病等位基因型（图1b、表2）。

表2 Fhb1 和Fhb7 基因在155 份江苏淮北小麦新品系中的分布

图1 部分小麦新品系中Fhb1 和Fhb7 基因检测结果

2.2 Fhb1 和Fhb7 基因在155 份江苏淮北小麦新品系中的分布

根据检测结果，155 份小麦新品系中，有4 份含有抗病基因Fhb1，所占比例为2.6%；其余151 份为感病等位基因fhb1，所占比例为97.4%。检测到1 份材料含有抗病基因Fhb7，所占比例为0.6%；154 份含有感病等位基因fhb7，所占比例为99.4%。从基因组合分布来看，fhb1/fhb7 的分布频率最高，为97.4%；含Fhb1/fhb7 基因组合的品系次之，有3 份，所占比例为1.9%；分布频率最低的组合为fhb1/Fhb7，同时含有2 个抗性基因的Fhb1/Fhb7 基因型品系只有1 份，所占比例为0.7%（表3）。这表明Fhb1 和Fhb7 抗性基因在现有淮北小麦新品系中的分布较少，可进一步扩大这2 个抗性基因的使用，提高育成品种的赤霉病抗性水平。

表3 小麦新品系中抗性基因Fhb1 和Fhb7 不同基因型的分布

2.3 单基因及不同基因组合在不同年度淮北小麦新品系中的分布

根据上述检测结果，对供试小麦新品系进行3 个年度划分，分别统计抗性基因及其基因组合的年度间分布特点。2017—2018年，61 份小麦新品系中未检测到含有Fhb1 或Fhb7 抗病等位基因的材料，在基因型分布上以fhb1/fhb7 感病等位基因组合形式存在。2018—2019年，48 份小麦新品系中检测到含有Fhb1 和Fhb7 抗病基因的材料分别为2 份和1 份，所占比例分别为4.2%和2.1%；同时含有2 个抗病基因的材料有1 份，所占比例为2.1%。2019—2020年度，46 份小麦新品系中检测到含有Fhb1 抗病等位基因的材料有2 份，所占比例为4.3%；未检测到含有Fhb7 抗病等位基因的材料；在基因组合中含fhb1/fhb7 的品系数较多，所占比例为95.7%，而其他3 种有利基因组合的年度间变幅并不明显（表4）。

表4 不同年份小麦新品系中Fhb1 和Fhb7 基因分布

表2（续）

3 讨论与结论

小麦赤霉病是极具毁灭性且防治困难的真菌性病害，是农业领域的世界性难题，严重威胁我国小麦产业发展[19]。长期的生产实践证明，小麦抗赤霉病品种的选育和利用是防治该病流行危害的经济有效措施。然而，传统小麦抗赤霉病育种是在充分发病的前提下，依据植株病害发生程度进行选择，不仅耗时费力而且易受环境影响，准确性差。近年来，随着分子生物学的发展和基因组学研究的深入，我国科学家在小麦抗赤霉病基因克隆和功能分析等方面取得了重大进展。Fhb1 是最早发现于我国小麦品种苏麦3号中的一个持久、稳定抗性基因，是目前公认的赤霉病抗性效应最大的位点。LI 等[9]和SU 等[20]研究发现，该基因编码一个富含组氨酸的钙离子结合蛋白（histidine-rich calcium-binding protrin，His），是我国特有的优异小麦基因资源。Fhb7 源于长穗偃麦草7E 染色体长臂末端，是通过远缘杂交转移至栽培小麦中的一个高效抗赤霉病基因[16]。WANG 等[11]研究发现，该基因编码一种谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST），能够打开呕吐毒素的环氧基因，并催化形成谷胱甘肽加合物，从而产生解毒效应。不仅如此，Fhb1 和Fhb7 基因即使在不同遗传背景条件下，也能有效提升小麦对赤霉病的抗性水平，具有广谱抗性。

为提高Fhb1 和Fhb7 基因的选择效率，已有研究人员设计出不同类型的分子标记筛选其抗病基因型，并鉴定出一批携带目标基因的优异材料，减少了小麦抗赤霉病育种的盲目性。本研究利用Fhb1 和Fhb7 的基因标记，对155 份小麦新品系进行基因型检测，明确这些抗性基因及基因组合在江苏省淮北地区的利用及分布状况。155 份小麦新品系中fhb7基因的出现频率最高，为99.4%，且基因型分布中多以fhb1/fhb7 感病基因组合存在，而携带Fhb1 和Fhb7 抗病等位基因的材料所占比例分别为2.6%和0.7%，明显低于其感病等位基因的分布频率。进一步对2017—2018年、2018—2019年和2019—2020年Fhb1、Fhb 7 基因分布状况进行分析，发现与2017—2018年比较，近年这两个抗病基因的出现频率明显提高，说明通过遗传育种改良突破了该抗病基因向半冬性小麦转移的品种生态类型限制，为提升江苏省淮北小麦的赤霉病抗性奠定了基础。

受气候变暖以及秸秆还田等耕作制度的改变影响，江苏淮北的赤霉病害呈蔓延趋势，2010年小麦赤霉病在苏北沿海地区重发，为2004年以来发生最为严重的一年，至2020年11年中就有2010、2012年2年大流行，2014、2015、2016、2018年4年局部地区偏重发生[21-25]。王震等[26]对江苏省北部14 个主栽小麦品种的赤霉病抗性进行鉴定，结果在单花滴注条件下仅有2 个达到中感水平；常蕾等[27]对97 份小麦高代品系进行赤霉病抗性鉴定，发现56 份淮北品系中，仅有5 份达到中感及以上水平。本研究中155 份小麦新品系仅检测到4 份含有Fhb1 抗性基因的材料，1 份含有Fhb7 抗性基因的材料，可见该区域小麦抗赤霉病育种形势仍然严峻，要充分利用好现有抗病基因，不断挖掘新的优异基因和抗源材料，通过常规育种手段结合分子标记辅助育种技术，实现目标基因的直接选择和高效聚合，从而快速、有效提升育成品种的赤霉病抗性水平，促进淮北小麦的生产发展，保障江苏省粮食安全。