四合木内生放线菌RE4的分离鉴定及其促生活性研究

孙 莹，甘 霖，林 睿，李登高，白 薇

（1.内蒙古农业大学植物逆境生理与分子生物学自治区重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；2.北京优胜辉煌教育，北京 100000）

全世界大约有300 000 种植物物种[1]。放线菌作为内生共生菌存在于植物的不同部位，包括根、茎、叶[2]。在与植物长期共同进化的过程中，内生菌可以帮助植物适应环境、吸收营养、抵御病原菌的侵害[3]，促进植物生长的内生菌有能力在植物内部定居，并建立一种特殊的关系，在这种关系中，双方都可以获益[4]。据报道，植物内生放线菌是内生菌群落重要组成部分，而内生菌通过多种机制促进植物生长，这些机制包括磷酸盐溶解活性[5]，植物激素的生产[6]、固氮[7]、铁载体生物合成等[8]，并提供必要的营养物质给宿主植物[9]。放线菌不仅拥有独有的特征，还能够产生化学上多样的生物活性次级代谢物[10]；许多世界性的、高度多样化的内生菌，存在于每一个陆地环境中，从极端条件，包括深海，到每一个土壤样品及与其他生物的关联或共生体[10]。放线菌是众所周知的抗生素生产者，也是一系列生物活性化合物的生产者[11]。

MATSUMOTO 等[12]从植物根部分离了1 000 多株放线菌，对其生物活性代谢物进行了鉴定和分析，并对其产生次生代谢物的生物合成基因进行了研究。KUNCHAROEN 等[13]对从泰国获得的14 种植物根部分离的37 株内生放线菌，根据表型特征和16S rRNA 基因序列将其分离物鉴定为小单孢菌属（21 个分离物）、链霉菌属（14 个分离物）、植物单孢菌属（1 个分离物）和多形孢菌属（1 个分离物）的成员。KUNCHAROEN 等[14]从芭蕉根中分离到2 株放线菌MS1-9 和NGC1-4，研究表明，菌株MS1-9 和NGC1-4 分别与小单孢菌DSM 43363T、JCM 克氏菌12869 和白骨壤菌DSM 45758T 密切相关。

四合木（Tetraena mongolica）是我国特有的蒺藜科单属种落叶小灌木[15]，主要分布于内蒙古自治区西北部乌海市，该地区属常年干旱少雨、昼夜温差大、日照时间长、多风沙的温带大陆性气候，这种生态环境使四合木成为一种强旱生植物，为了适应恶劣的生长环境，四合木授粉率、结实率极低，加上过度放牧、樵采、开垦、建立工业设施等人类活动的影响，导致四合木生长空间不断被侵占，个体数量不断下降[16]，因此，对四合木种群的保护迫在眉睫。本研究以四合木根为试验材料，从根中分离和鉴定内生菌菌株，并探究对多种病原菌的拮抗作用及对四合木种子的促生作用，以期为四合木的生长和保护提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品采集 四合木根于2015年在内蒙古乌海市海南区拉僧庙镇采集。

1.1.2 主要试剂及培养基 主要试剂NaCl、ZnSO4、不同种类碳源物质、过氧化氢溶液等均购自上海国药集团化学试剂有限公司；培养基分别为高氏一号培养基、ISP2 培养基、PDA 培养基、MS 培养基。

1.1.3 供试菌株 尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）由内蒙古农业大学农学院胡俊教授惠赠。核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）由内蒙古农业大学生命科学学院冯福应教授惠赠。致病疫霉（Phytophthora infestans，编号HQK8-3），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，编号CMCC26003），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，编号3-1），酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，编号C2-2）由内蒙古农业大学生命科学学院刘惠荣教授惠赠。大肠杆菌（Escherichia coli，编号DH5α）由内蒙古农业大学白薇课题组实验室保存。通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCC-TGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3′）。

1.2 促生菌株的分离纯化

以四合木根为试验材料，依次经过75%乙醇处理3 min、1%升汞处理3 min、75%乙醇处理30 s，无菌水冲洗3 次。然后与15 mL 无菌水混合研磨，4 ℃静置过夜后取上清液涂布于含有终浓度为50 μg/mL重铬酸钾的高氏一号培养基，30 ℃培养30 d。待菌落长出后挑取外观不同的单菌落划线纯化，直至获得纯培养物。

1.3 内生菌菌株的鉴定

1.3.1 形态学观察 选取长势良好的单菌落，接种于ISP2 培养基，30 ℃培养10～15 d，观察菌株生长情况并记录菌落形态、颜色、可溶性色素。按传统方法进行革兰氏染色，在60 倍显微镜下进行观察。纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、硝酸盐还原酶活性测定，不同种类碳源利用情况，重金属耐受能力［Hg2+/%（W/V）］测定和pH 值、盐度［NaCl/%（W/V）］、温度生长适应范围测定等试验方法参照参考文献［17］。

1.3.2 分子鉴定 以分离到的内生菌菌株基因组DNA 为模板，27F 和1492R 为引物，扩增16S rRNA基因，PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司纯化及测序，所得结果通过NCBI 在线网站分类分析并获得与该内生菌近缘的模式种序列，利用MEGA 6.0 软件中相关模块构建系统发育树。

1.4 内生菌菌株对四合木种子促生试验

将浸泡24 h 的四合木种子用70%的乙醇浸泡1 min，无菌水冲洗3 次，再用3%的次氯酸钠溶液浸泡3 min，无菌水冲洗3 次。设将四合木种子浸入内生菌菌株的菌液5 min 后接种于1/2MS 培养基为试验组，浸入高氏一号液体培养基5 min 后接种于1/2MS培养基为对照组，于光照培养箱中24 ℃、光暗周期16 h/18 h 培养30 d 后观察株高、根长、生根率、发芽率。

1.5 内生菌菌株拮抗活性检测

参照参考文献［8］的方法测定内生菌菌株对病原菌的拮抗作用。供试菌株参见1.1.3，并设将内生菌菌株的菌饼接种于含有病原菌的培养基为试验组，接种病原菌和高氏一号培养基菌饼的PDA 培养基为对照组，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌于37 ℃、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌于30 ℃培养5 d，尖孢镰刀菌、大丽轮枝菌、核盘菌于18 ℃培养7 d，致病疫霉于18 ℃培养9 d。观察抑菌效果并测量抑菌直径，每个处理重复3 次。

2 结果与分析

2.1 四合木根内生菌菌株的分离纯化及鉴定

将用高氏一号培养基从四合木根中分离得到的内生菌菌株命名为RE4。初步形态学鉴定RE4 为好氧型革兰氏阳性（G＋）菌株，在30 ℃下，ISP2 培养基上培养15 d 后形成白色圆形菌落，气生菌丝为灰白色，基内菌丝为褐色（图1）。RE4 菌株常见的生理生化特征见表1，能利用纤维素、淀粉、脂肪，具有硝酸盐还原酶活性，能利用多种碳源，具有一定的重金属耐受能力（Hg2+0.03%～0.05%） 和较宽的pH 值（5.0～12.0）、盐度（NaCl 0～20%）、温度生长适应（20～45 ℃）。根据放线菌鉴定手册描述，且综合生理生化特征分析，初步鉴定RE4 为放线菌，属于链霉菌属（Streptpmyces）。

表1 菌株RE4 的生理生化特征

图1 菌株RE4 形态

利用细菌通用引物27F 和1492R 扩增菌株RE4 的16S rRNA 基因序列并测序，将结果提交至NCBI 中的基因数据库进行比对，获得登录号7XJ7USB301R，选取相似度高的序列，利用MEGA 6.0邻接法构建基于16S rRNA 基因序列的系统发育树（图2）。结果表明，菌株RE4 与模式菌株暗灰链霉菌（Streptomyces canus CSSP527T）的相似性达100%，且进化距离相对模式菌株较近，进一步确定菌株RE4 为暗灰链霉菌（Streptomyces canus）。

图2 菌株RE4 基于16S rRNA 基因的系统发育进化树

2.2 菌株RE4 对四合木种子促生效应检测

由表3 和图3 可知，将表面消毒后的四合木种子浸于RE4 菌悬液，接种于MS 培养基，培养30 d后，株高、根长、生根率、发芽率均高于对照组，分别增加了27.89%、197.09%、26 个百分点和4 个百分点，根长与对照组相比差异显著（P＜0.05），结果表明，菌株RE4 对四合木种子萌发和幼苗生长有较好的促进作用。

表3 接种菌株RE4 对四合木株高、根长、生根率、发芽率的影响

图3 菌株RE4 对四合木种子的促生作用

2.3 菌株RE4拮抗活性检测

采用平板对峙法检测菌株RE4 的拮抗活性（图4），结果表明，菌株RE4 靶标菌均有一定的拮抗活性。对真菌的拮抗活性检测结果表明，菌株RE4对大部分病原真菌的拮抗活性高于50.0%；对大丽轮枝菌拮抗效果最强，抑菌率为68.4%；其次是尖孢镰刀菌和核盘菌，抑菌率分别为63.8%和53.8%；对致病疫霉拮抗效果最弱，抑菌率仅为38.6%。对酿酒酵母和细菌的拮抗活性检测结果表明，菌株RE4 对酿酒酵母的拮抗活性最强，抑菌直径可达17.04 mm；其次是枯草芽孢杆菌，抑菌直径为12.45 mm；对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的拮抗活性相近，抑菌直径分别为11.39 mm 和11.35 mm。

图4 菌株RE4 对细菌和真菌的拮抗作用

3 讨论与结论

植物内生菌定殖于健康的植物组织内部，不仅可以抵御植物自身的防御反应，还能为宿主植物提供保护，特别是植物内生放线菌，能够通过产生抗生素、酶等多种次级代谢产物帮助宿主植物提升农艺性状、抵抗恶劣的自然环境和抵御各种病原菌的侵害[10]。研究人员已经从不同的植物中分离到了许多具有生防价值的内生放线菌，梁新冉[18]从番茄中分离到1 株可以促进番茄和黄瓜生长的链霉菌；史晓晶[19]从艾草内分离到了具有抑菌活性的Ac10 和Ac16 菌株；一些药用植物的内生放线菌可以产生类似宿主植物的具有抗菌、抗肿瘤等能力的活性物质[20]。随着植物内生放线菌研究的不断深入，较为温和的环境下分离到的促生菌资源日益减少，研究者们开始更多地关注极端环境和特殊植物。TOHTY等[21]从新疆的盐湖中分离到1 株嗜碱放线菌；王景丽[22]从烟台渤海盐泥沉积物中分离到1 株新的嗜盐菌；王勇等[23]研究发现，牛栏山大曲中，高温放线菌占14.78%；赵珂等[24]从四川雅安的药用植物中分离到的放线菌多数对致病真菌和细菌有广谱的拮抗活性。

放线菌是具有工业价值的一类重要细菌。本研究使用的菌株是从四合木根中分离出来的，通过16S rRNA 基因鉴定的[25]，结果表明，RE4 属于暗灰链霉菌（Streptomyces），与暗灰链霉菌（Streptomyces canus CSSP527T）的相似性为100%。采用平板对峙法对RE4 菌株的拮抗活性进行检测，发现具有较为广谱的拮抗特征，可以拮抗所有的供试靶标菌。根是植物从外界环境中汲取各种生命活动必需的营养物质的重要器官，根长的增加有助于植物从外界环境中吸收更多的营养物质[26]。在本研究中，与菌株RE4共培养的四合木无菌苗生长状态优于对照组，株高根长的增长率分别为27.89%、197.09%，生根率、发芽率分别增加26 个百分点、4 个百分点，表明菌株RE4 具有促生作用。