PCR快速检测种子携带绿豆晕疫病菌方法的应用

田晓燕，贺小勇，孔庆全，赵存虎，陈文晋，李志栋，贾转青

（1.内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所，内蒙古呼和浩特 010031；2.呼和浩特市农业技术推广中心，内蒙古 呼和浩特 010030；3.呼和浩特市玉泉区教育教学研究中心，内蒙古 呼和浩特 010031）

绿豆主产区在亚洲，全球有20 多个国家种植[1-3]。绿豆在我国已有2 000 多年的栽培历史，年种植面积在1 200 万hm2左右，总产量约100 万t，是世界上最大的出口国[4]。近年来，随着产业的快速发展，出现了许多新的病虫害，特别是绿豆晕疫病[5-6]，在全国主产区迅速传播和蔓延，造成严重的产量损失，成为我国绿豆生产的主要威胁。晕疫病主要为害叶片，也侵染豆荚和种子[7-8]。带病种子长出的幼茎呈环状腐烂，表现为萎蔫并导致幼苗死亡[6]。该病菌主要通过种子传播，种子可以携带大量病原菌，从一个生长季传播到下一个生长季，从一个地方扩展到另一个地方。据TAYLOR 等[9]报道，感晕疫病症状轻微或无症带病的种子传播率分别为35%和52%。防止绿豆晕疫病流行唯一实用和有效的方法是使用无病健康种子[10]。目前，绿豆晕疫病田间快速诊断技术尤其是种子带菌的检测技术报道较少，传统的检测手段存在鉴定时间长、技术复杂、漏检率高等缺点，给该病害的早期防治带来困难。鉴于近年来绿豆晕疫病在我国的发生逐年加重，无有效的化学药剂和抗病品种防治，本研究为了增加实验室检测的准确度，探索建立一套简便实用、快速检测绿豆种子携带病原菌的技术——PCR 快速检测方法，以期为测定种子的健康状况提供信息，为种子生产、调运过程中病害传播的防治提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 已分离鉴定的绿豆晕疫病病原菌（Pseudomonas syringae pv. phaseolicola），保存于内蒙古自治区农牧业科学院植物保护研究所。

1.1.2 供试绿豆种子 易感品种“冀绿7 号”种子。

1.1.3 绿豆晕疫病菌特异性引物筛选与合成 经过前期大量的引物筛查试验，共筛选出对检测绿豆晕疫病菌灵敏度较高的7 对引物，分别是P1/P2[11]、HB14F/HB14R[12]、62a/63a[13]、P3.1/P5.1[14]、P3004L/P3004R[15]、B4-1-F/B4-1-R 和B4-2-F/B4-2-R（根据分离鉴定绿豆晕疫病病原菌的基因序列，交由大连宝生物工程有限公司设计并合成）。所有引物PCR 反应体系采用20 μL 体系：1 μL 模板（50 ng DNA 或者1 μL 菌悬液，2.5 μL 10×PCR buffer，0.2 mmol/L dNTP，1.5 U Taq 酶，引物各0.1 μL），所有引物序列由大连宝生物工程有限公司合成（表1）。

表1 引物及其序列

1.2 试验方法

1.2.1 特异性引物灵敏度的检测 用无菌水配制浓度依次为1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100CFU/mL 9 个浓度梯度的绿豆晕疫病菌菌悬液，并以其作为PCR 反应的模板，检测特异性引物的灵敏度，选择灵敏度较高、专一性较好、稳定性较强的引物进行下一步试验。

1.2.2 模拟种子表面带菌检测 取表面健康无病的“冀绿7 号”种子若干，放入三角瓶，盖上棉塞高压灭菌，然后用无菌水反复冲洗，尽可能地把种子表面残留的灰尘等杂质冲洗下来。再用1×108CFU/mL 的菌悬液50 mL 浸泡50 粒处理好的种子2 h，在无菌条件下，把种子晾干。将人工模拟带菌的种子用50 mL无菌水浸泡，28 ℃摇动30 min，取种子浸泡液并将其依次稀释为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100CFU/mL 浓度的菌悬液，用这9 个浓度的菌悬液作PCR 模板，检测模拟状态下特异性引物的灵敏度。

1.2.3 种子带菌率检测 分别将100、50、20、10、5、2.5、1.25、0.625 粒带病菌的“冀绿7 号”种子（用1×108CFU/mL 晕疫病菌菌悬液浸泡处理过）加入健康绿豆种子，使每份总量达到1 000 粒，得到10%、5%、2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%、0.062 5%带菌率样品。每份带菌样品用500 mL 无菌水浸泡，于28 ℃振荡洗涤，每隔1 h 取洗涤液1 μL 作为模板直接进行PCR 反应，以晕疫病菌菌悬液为阳性对照，其他菌作阴性对照，每个处理3 次重复。

2 结果与分析

2.1 特异性引物灵敏度检测结果

分别以9 个浓度梯度的绿豆晕疫病菌菌悬液作为PCR 模板，对筛选出的7 对特异性引物进行灵敏度检测。检测结果显示，引物B4-1-F/B4-1-R和B4-2-F/B4-2-R 检测的最小菌悬液浓度都为1×101CFU/mL，引物HB14F/HB14R 检测的最小菌悬液浓度为1×103CFU/mL，引物P3.1/P5.1 检测的最小菌悬液浓度为1×105CFU/mL，其余3 对引物检测的最小菌悬液浓度均在1×106CFU/mL 以上，灵敏度不高、效果较差、信号较弱，由此确定用以上4 对灵敏度较高、信号较强的引物继续进行模拟种子带菌检测试验，具体PCR 检测结果见图1。

图1 灵敏度高的引物菌悬液浓度梯度PCR 检测结果

2.2 模拟种子表面带菌PCR 检测结果

模拟种子表面带菌检测，用种子浸泡液作为PCR 的模板，检测结果显示，引物B4-1-F/B4-1-R和B4-2-F/B4-2-R 检测的最小菌悬液浓度均为1×104CFU/mL，引物HB14F/HB14R 检测的最小菌悬液浓度为1×106CFU/mL，引物P3.1/P5.1 在模拟种子带菌检测中灵敏度较差、效果不好、信号较弱。由此试验结果确定引物B4-1-F/B4-1-R、B4-2-F/B4-2-R 和HB14F/HB14R 继续进行种子带菌率检测，结果见图2。

图2 模拟种子表面带菌PCR 检测结果

2.3 种子带菌率检测结果

据以上试验结果总体分析，最终用筛选出的灵敏度高、信号强的3 对引物做种子带菌检测，其中，引物B4-1-F/B4-1-R 和B4-2-F/B4-2-R 检测的灵敏度为振荡洗涤1 h 即可检出全部带菌样品；引物HB14F/HB14R 检测的灵敏度为振荡洗涤1 h 可检出带菌率为10%、5%和2%的样品，振荡洗涤4 h 后带菌率0.125%的样品出现条带，并且可检出的种子最终带菌率为0.125%。筛选出的这3 对特异性引物灵敏度高、特异性强、稳定性好，即可应用于绿豆种子表面带菌快速检测，结果见图3。

图3 种子带菌率PCR 检测结果

3 结论与讨论

绿豆晕疫病是一种细菌性病害，该病在我国绿豆各大主产区的危害日益加重。目前，生产上尚无有效的防治方法。种子带菌在病害传播过程中充当重要传播媒介，绿豆晕疫病最重要的初侵染来源就是种子带菌，种子带菌的快速检测是防止该病害流行蔓延的重要环节。种子带菌检测的目的是测定种子样品的健康状况，检测种子是否携带特定病原菌，为种子质量提供信息。种子带菌检测不但要求准确，而且要求快速、便捷，这样才能为种子健康检验行业服务。

目前对该病原菌的分子检测报道较多，但大多是针对纯菌株的研究，未见有针对种子样品检测的报道。因此，加快对绿豆晕疫病菌的快速检测技术研究，已成为当前越来越迫切需要解决的问题。国内外现行对晕疫病菌的PCR 检测方法大多是基于菜豆毒素相关基因序列实现的[16-17]，具有较高的特异性，但几乎所有的PCR 检测方法都是针对大豆种子或者是菜豆种子，鉴于近年来绿豆晕疫病在我国发生危害较重，本研究通过对绿豆晕疫病菌不同浓度菌悬液进行一系列的PCR 反应，系统比较不同引物对不同浓度菌悬液的灵敏度，筛选出3 对引物的灵敏度较高、专一性较强、稳定性较好。引物B4-1-F/B4-1-R和B4-2-F/B4-2-R 检测的最小菌悬液浓度均为1×104CFU/mL，且振荡洗涤1 h 即可检出带菌率为0.062 5%的种子样品；引物HB14F/HB14R 检测的最小菌悬液浓度为1×106CFU/mL，且振荡洗涤4 h 后可检出带菌率为0.125%的种子样品。经验证，这3 对引物均可以用于种子带绿豆晕疫病菌检测，PCR 检测技术既节省了分离病原菌消耗的大量时间，结果又快速准确，灵敏度较高，对于绿豆种子带菌检测是十分方便快捷的。

绿豆晕疫病菌已构建的传统检测方法主要有分离培养法[18]、试种法[19]和生理生化法[20]，但灵敏度较低，特异性不高，检测周期较长。随着现代生物技术的发展，多种方法可用于检测病原菌，主要包括酶联免疫法、传统PCR 法、BIO-PCR 法[21-23]等，但容易受抑制因子影响造成假阴性等问题，对结果判断产生困扰。以上检测方法主要靠分离培养病原菌，通过生理生化、致病性测试等试验进行鉴定。与之相比PCR 快速检测方法方便快捷许多，直接用种子浸泡液作PCR 反应的模板，3 对特异性引物PCR 检测时间较短、特异性强、灵敏度高。此方法能进一步增加检测绿豆晕疫病菌的专一性，为生产中种子携带极少量绿豆晕疫病病菌即可侵染流行发病提供更好的解决办法，提高了检测方法在生产应用中的可行性，可为绿豆晕疫病菌的检测工作提供技术支持。