猪苓多糖联合硼替佐米促进多发性骨髓瘤U266细胞的凋亡和自噬

王 静，李 芳，蒋 鸣，刘红霞，陈金娥

（江苏医药职业学院药学院，江苏 盐城 224005）

多发性骨髓瘤是排名第二位的成人常见血液系统恶性肿瘤，特征是骨髓内恶性浆细胞的克隆性增殖［1］。尽管几种有效的治疗药物进入临床，如蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米、卡菲佐米和伊沙佐米）、免疫调节药物（如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺）和单克隆抗体，在治疗多发性骨髓瘤方面取得了巨大的进步，但其易复发性和治疗的长期性仍然困扰着患者［2］。此外，长期使用这些药物会引起许多不良反应，且在治疗后期，患者会不同程度的产生耐药性［3］。因此，迫切需要开发新的抗骨髓瘤药物或新的治疗策略，以提高或保持现有药物的治疗效果，并降低它们对正常细胞的毒性。

中医药作为恶性肿瘤的临床辅助治疗手段，可以提高机体免疫力，减轻化疗副作用，提高化疗药物的疗效。猪苓是一种在中国被广泛使用的药用真菌，是多发性骨髓瘤辅助治疗的常用药物［4］。猪苓多糖（polyporus polysaccharide，PPS）是猪苓的主要生物活性物质，分子量约为1.6×105u［5］。研究显示，PPS可增加干扰素γ刺激的巨噬细胞分泌白细胞介素6，-1β和-23等免疫因子，增强宿主免疫调节作用，诱导肿瘤细胞凋亡［6-7］。PPS通过使肿瘤微环境中的巨噬细胞极化为M1亚型抑制膀胱癌［8］。PPS与卡介苗合用不仅能抑制膀胱癌细胞的增殖，还可以减少卡介苗的副作用。主要通过增加CD86、CD40和Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表达，发挥协同抑制效应。PPS通过抑制卡介苗对膀胱癌细胞NF-κB信号通路的过度激活，从而减轻卡介苗对膀胱癌细胞的不良反应［9-10］。硼替佐咪（bortezomib，BTZ）是多发性骨髓瘤的一线治疗药物。通常用于复发性或难治性骨髓瘤的治疗，具有临床疗效好，副作用可控的特点，患者长期使用BTZ可能会出现耐药性［11-12］。研究显示，BTZ通过转录激活因子3（activating transcription factor 3，ATF3）触发miR-135a-5p依赖性的细胞凋亡抑制多发性骨髓瘤细胞［13］。BTZ可通过自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3B（microtubuler-associated protein light chain 3B，LC3B）和P62调控自噬［14］。本研究通过PPS联合BTZ处理U266细胞，检测细胞的凋亡、自噬相关蛋白以及Akt/mTOR信号通路关健蛋白的表达水平，评估PPS联用BTZ治疗多发性骨髓瘤的潜在疗效及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂和主要仪器

PPS（南京泽朗生物科技有公司）。PPS溶解在细胞培养液中，通过0.22 μm的滤膜过滤，以供实验使用。BTZ（西安杨森制药有限公司）；RPMI-1640高糖培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）、青-链霉素（中国碧云天公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁公司）；凋亡检测试剂盒（中国凯基公司）；小鼠抗人哺乳动物西罗莫司（雷帕霉素）靶蛋白（mammalian target of Rapamycin，mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）单克隆抗体（美国Proteintech公司）；凋亡试剂盒和小鼠抗人蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）和P-Akt单克隆抗体（英国Abcam公司）；小鼠抗人LC3B、P62单克隆抗体（美国CST公司）；小鼠抗人Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶3单克隆抗体（中国Abclone公司）；辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体（中国联科公司）；CO2孵育箱和酶标仪（美国Thermo公司）；凝胶电泳相关器材（美国Bio-Rad公司）；GALLIOS流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司）。

1.2 U266细胞和培养

人多发性骨髓瘤细胞系U266购自中国科学院细胞中心（上海）。U266培养于RPMI-1640培养基、10%胎牛血清、1%双抗配制的完全培养基中，37℃ 5% CO2培养箱中培养。

1.3 CCK-8法检测U266细胞存活率

以每孔5×103个细胞的密度接种置于96孔板中。细胞分细胞对照组、PPS 12.5，25，50，100，200 和 400 μmol·L-1组、BTZ 10，20，30，40，60 和80 nmol·L-1组，PPS 50 μmol·L-1+BTZ 0，10，20，30，40，60和80 nmol·L-1组，细胞对照组加入等量细胞培养液。培养48 h后，每孔加入CCK8溶液10 μL，置孵育箱继续培养4 h，用酶标仪在450 nm处测量吸光度（A450nm）计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组A450nm-空白组A450nm）/（细胞对照组A450nm-空白对照组A450nm）×100%。另设PPS 12.5，25，50 μmol·L-1+BTZ 10，20，40和80 nmol·L-1不同浓度的联合用药组，利用Calcusyn软件计算各组联合用药指数（combine index，CI），CI值=1，表示相加作用，CI＞1，表示拮抗作用，CI＜1，表示协同增效作用［15］。

1.4 流式细胞术检测U266细胞凋亡率

细胞分细胞对照组、PPS 20 μmol·L-1组、BTZ 25 nmol·L-1组和PPS 20 μmol·L-1+BTZ 25 nmol·L-1组，培养48 h后收集细胞。4℃，300×g离心10 min，PBS洗涤，加入Annexin V和碘化丙啶室温避光处染色15 min，在流式细胞仪上检测细胞凋亡情况，结果用FlowJo软件（8.7.3版本）进行分析。

1.5 Western印迹法检测细胞凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白以及Akt和mTOR蛋白磷酸化水平

取1.4分组处理的细胞提取蛋白质，并使用BCA试剂盒进行定量。用15% SDS-PAGE电泳分离蛋白，转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，加对应的一抗在4℃孵育过夜。Bax（1∶1000），Bcl-2（1∶1000），胱天蛋白酶3（1∶2000），活化胱天蛋白酶 3（1∶2000），LC3B（1∶4000），P62（1∶4000），Akt（1∶4000），P-Akt（1∶2000），mTOR（1∶4000）和p-mTOR（1∶2000）。37℃下与二抗（1∶10000）孵育1 h。ECL显色，凝胶成像系统显影拍照，软件分析条带积分吸光度值（integrated absorbance，IA），以目标蛋白与内参蛋白IA比值表示蛋白相对表达水平。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 猪苓多糖联合硼替佐米对U266细胞存活的影响

图1A结果表明，与细胞对照组相比，PPS 12.5～400 μmol·L-1作用于U266 细胞 48 h后，细胞存活率显著降低（P＜0.01）。图1B实验结果表明，BTZ 10～80 nmol·L-1作用于U266细胞48 h后，细胞存活率显著降低（P＜0.01）。图1C实验结果表明，与PPS 50 μmol·L-1相比，PPS 50 μmol·L-1+BTZ 10～80 nmol·L-1作用于U266细胞48 h后，细胞存活率显著降低（P＜0.01）。

Fig.1 Effect of polyporus polysacharide（PPS）combined with bortezomib（BTZ）on viability of U266 cells by CCK-8 assay.The cells were treated with PPS，BTZ or PPS combined with BTZ for 48 h.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PPS 50 μmol·L-1group.

PPS 12.5～50 μmol·L-1+BTZ 10～80 nmol·L-1联合用药组作用48 h后，Calcusyn软件计算出各浓度组合的CI值均＜1，表示PPS联合BTZ作用于U266细胞时表现为协同增效作用。根据实验结果确定 PPS 20 μmol·L-1和 BTZ 25 nmol·L-1为后续联合用药浓度。

2.2 猪苓多糖联合硼替佐米对U266细胞凋亡的影响

Annexin V和PI双染色结果显示（图2），PPS 20 μmol·L-1和BTZ 25 nmol·L-1组较细胞对照组的凋亡率明显升高（P＜0.01）。PPS 20 μmol·L-1+BTZ 25 nmol·L-1两药联用后，较单独用药组凋亡率明显升高（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of PPS combined with BTZ on apoptosis rate in U266 cells by flow cytometry.U266 cells were treated with PPS 20 μmol·L-1，BTZ 25 nmol·L-1，and PPS 20 μmol·L-1+BTZ 25 nmol·L-1for 48 h，respectively.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PPS group；△△P＜0.01，compared with BTZ group.

2.3 猪苓多糖联合硼替佐米对U266细胞Bax/Bcl-2和活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3比值的影响

Western印迹结果显示（图3），与细胞对照组相比，PPS 20 μmol·L-1和 BTZ 25 nmol·L-1组 Bax/Bcl-2、活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3比值明显升高（P＜0.01）。与单用PPS或BTZ组相比，PPS+BTZ组Bax/Bcl-2、活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3比值明显升高（P＜0.01）。

Fig.3 Effect of PPS combined with BTZ on protein expression levels of Bcl-2/Bax and cleaved-caspase 3/caspase 3 in U266 cells by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.B and C were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PPS group；△△P＜0.01，compared with BTZ group.

2.4 猪苓多糖联合硼替佐米对U266细胞P62蛋白和LC3BⅡ/Ⅰ比值的影响

细胞自噬相关蛋白的表达结果表明（图4），与细胞对照组相比，PPS 20 μmol·L-1和 BTZ 25 nmol·L-1组P62蛋白表达显著降低（P＜0.05），LC3BⅡ/Ⅰ比值明显升高（P＜0.01）。与PPS 或BTZ组相比，PPS+BTZ组P62蛋白表达明显降低（P＜0.05），LC3BⅡ/Ⅰ比值明显升高（P＜0.01）。

Fig.4 Effect of PPS combined with BTZ on protein expression level of P62 and ratio of microtubuler-associated protein light chain 3B（LC3B）Ⅱ/Ⅰ in U266 cells by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with cell control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with PPS group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with BTZ group.

2.5 猪苓多糖联合硼替佐米对U266细胞Akt和mTOR蛋白磷酸化水平的影响

Western印迹结果（图5）表明，与细胞对照组相比，PPS和BTZ单用组Akt和mTOR磷酸化水平显著降低（P＜0.01），与PPS或BTZ单用组相比，PPS+BTZ组Akt和mTOR磷酸化水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.5 Effect of PPS combined with BTZ on phosphorylation levels of protein kinase B（Akt）and mammalian target of Rapamycin（mTOR）in U266 cells by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment.B was the semi-quan⁃titative result of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group；##P＜0.01，compared with PPS group；△P＜0.05，△△P＜0.01，compared with BTZ group.

3 讨论

本研究结果显示，PPS联合BTZ能明显抑制U266细胞的增殖，并且联合用药后CI均＜1，提示PPS联合BTZ对抑制U266细胞增殖具有协同增效作用。

恶性肿瘤细胞能够逃脱细胞凋亡，引起异常增殖和转移。因此诱导肿瘤细胞凋亡，是肿瘤治疗的有效手段。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡调控中发挥着重要作用。Bax和Bcl-2分别是促进凋亡和抑制凋亡的最主要蛋白，Bax/Bcl-2比值与肿瘤的发生发展密切相关［15］。当细胞在受到凋亡信号刺激后，线粒体膜的通透性增加，释放出细胞色素c，启动胱天蛋白酶级联反应引起凋亡［16］。本研究结果表明，PPS和BTZ联合用药后Bax/Bcl-2比值增加，活化胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3比值也显著增加，说明PPS和BTZ联合用药能够启动U266细胞凋亡。

自噬在肿瘤发生发展过程中是一把双刃剑，LC3是自噬标志性蛋白，有3种亚型：LC3A，LC3B和LC3C，在哺乳动物细胞内LC3B的总量比较恒定，是检测自噬体的常用标记物，另一个自噬标志性蛋白P62，是自噬的选择性底物，最终被自噬溶酶体降解，P62表达水平与自噬活性呈负相关［17］。有研究表明，BTZ可通过增加自噬水平发挥抗多发性骨髓瘤作用，还可以减少耐药性的发生［18］。本研究结果显示，PPS联合BTZ用药后P62蛋白表达水平显著降低，LC3BⅡ/Ⅰ比值显著升高，说明联合用药能够诱导U266细胞自噬。

凋亡与自噬之间存在着交互调控，二者共享多个调节分子，例如 NF-κB，P53，PI3K，Akt和 JNK等［19］。Akt作为PI3K/Akt/mTOR 信号通路的中枢蛋白，在多种肿瘤细胞中被异常激活，参与细胞增殖、迁移、凋亡和自噬等生物过程。mTOR为Akt的下游蛋白，是参与细胞自噬过程的重要负调控因子［20-21］。有研究表明，有些药物可以通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路拮抗多发性骨髓瘤增殖，促进U266细胞自噬和凋亡，耐药组中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR和LC3Ⅰ表达上调。提示PI3K/Akt/mTOR信号通路不仅参与U266细胞的自噬和凋亡，还可能与U266细胞的耐药有关［22］。本研究结果表明，PPS和BTZ联合用药可显著抑制Akt和mTOR的磷酸化水平，表明PPS联合BTZ通过抑制Akt/mTOR通路诱导U266细胞凋亡与自噬，并且可能还有减少U266细胞耐药性的作用。

综上所述，本研究发现PPS联合BTZ能抑制U266细胞增殖，并具有协同增效作用。能同时诱导骨髓瘤细胞的凋亡和自噬，其机制可能与抑制Akt/mTOR信号通路有关，PPS与BTZ合用是否影响其他的信号通路，以及对BTZ耐药方面的影响，还需进一步深入研究。