高效液相色谱法测定有机-无机复合肥料中4种抗生素的含量

邓 帆，龚 宁

(贵州省产品质量检验检测院 贵州贵阳 550014)

为了防止畜禽在生长过程中遭受病毒的感染，饲养场经常使用抗生素进行预防，但畜禽对抗生素不能完全吸收，无法吸收的抗生素便通过粪便排放了到自然环境中。有资料显示[1]，有机-无机复合肥料中有机组分主要为鸡粪、猪粪、牛粪、羊粪等畜禽粪污。饲养场中常用的抗生素主要有氨基糖胺类、四环素类、氯霉素类、多肽类等。如果长期施用含抗生素的有机-无机复合肥料，将会威胁土壤、水体和农产品的质量安全；人如果长期食用含有抗生素的产品，有可能会伤害人体的血液系统、肾脏、肝脏、心脏等，还会灭杀人体正常菌群，诱发耐药菌的产生。四环素类抗生素使用广泛，检出率较高，且常同时检出多种化合物。因此，对有机-无机复合肥料中四环素类抗生素含量的精准检测，在防止污染原料的非预期使用、避免环境污染、促进有机-无机复合肥料生产和粪肥还田、确保粮食安全和提高农产品品质等方面具有重要作用。

1 试验部分

1.1 试验原理

试样中的四环素类抗生素用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)-Mcllvaine-甲醇提取液振荡，离心提取，再通过氮吹仪浓缩，经固相萃取柱净化，浓缩、定容后，用高效液相色谱法进行测定，通过与保留时间比较进行定性，外标法定量。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 试剂

抗生素混合标准储备液：1 mg/mL。

甲醇(CH3OH)、乙腈(C2H3N)为色谱纯，德国默克公司；磷酸二氢钠(NaH2PO4)、EDTA(C10H14N2Na2O8)、水合草酸(C2H2O4·2H2O)、柠檬酸(C6H8O7)为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

EDTA溶液：称取EDTA 37.22 g，用水定容至1 000 mL，此溶液物质的量浓度为0.1 mol/L。

Mcllvaine溶液：0.4 mol/L磷酸二氢钾溶液1 000 mL与0.2 mol/L柠檬酸溶液294 mL混合，摇匀。

EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液：移取EDTA溶液、Mcllvaine溶液、甲醇按体积比1∶1∶2混合，用氢氧化钠或盐酸调节pH为中性。

1.2.2 仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪，配备紫外检测器、二极管阵列检测器，安捷伦科技有限公司；TDL-40B型离心机，上海安亭科学仪器厂；SHA-BA型机械振荡提取仪，上海巨纳科技有限公司；Turbo Vap Lv型氮吹仪，美国Caliper公司。

1.3 标准溶液系列的配制

标准溶液：移取1 mg/mL的4种抗生素混合标准储备溶液10.00 mL定容至100 mL，配成质量浓度为100 μg/mL的标准溶液。

标准溶液系列：移取标准溶液0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 mL至100 mL容量瓶中，用EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液定容，摇匀，配成质量浓度分别为0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的标准溶液系列。

1.4 样品的制备

1.4.1 目标物的提取

准确称取1～2 g(精确至0.1 mg)样品于50 mL棕色离心管中，加入EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液20 mL，于机械振荡提取仪提取20 min(室温，约25 ℃)，将离心管取出置于离心机上，以转速4 500 r/min离心10 min，离心后将上层溶液转移至50 mL容量瓶中；离心管中残渣依次用20、10 mL EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液重复上述步骤提取2次,合并上清液并定容至50 mL，待净化处理。

1.4.2 固相萃取装置净化

准确移取上清液5.00 mL置于氮吹仪上，室温(约25 ℃)吹至原体积的一半左右；加适量水稀释至体积约5 mL，以1 mL/min的速率通过已活化处理的固相萃取柱，依次用5 mL水、5 mL甲醇-水溶液淋洗固相萃取柱，减压抽干5 min；用5 mL草酸-甲醇溶液洗脱目标物，洗脱液用饱和NaOH溶液调至pH为5～6，置于氮吹仪吹至近干；用1 mL水溶解残渣，过0.22 μm的滤膜，待测[2]。

1.5 色谱条件

色谱柱：EC-C18柱，2.7 μm，3.0 mm×50 mm。

流速：0.8 mL/min。

柱温：色谱柱左右两端温度均为30 ℃。

进样量：20 μL。

检测波长：355 nm。

流动相A为甲醇-乙腈(1+1)溶液，流动相B为0.01 mol/L草酸溶液，梯度洗脱条件见表1。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

按照文献[3]中流动相条件进行试验，结果表明，流动相A为甲醇-乙腈(1+1)溶液，流动相B为0.01 mol/L草酸溶液时，可实现色谱峰的基线分离。20 μg/mL的4种抗生素混合标准溶液的色谱图见图1。

2.2 标准曲线与检出限

按色谱条件测定4种抗生素混合标准溶液系列，以抗生素的质量浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到4种抗生素的线性回归方程和相关系数，结果见表2。以3倍信噪比(S/N)计算4种抗生素的检出限[4]，结果见表2。

由表2可知，4种抗生素的质量浓度在0.1～20.0 μg/mL范围内呈线性，相关系数均不小于0.999 8，检出限为0.75～1.0 mg/kg。

2.3 精密度和回收试验

空白样品中添加1 mg/kg的4种抗生素混合标准溶液的色谱图见图2。在选定的试验条件下，取已知4种抗生素含量的同一样品3份，分别添加1、5、10 mg/kg的4种抗生素混合标准溶液进行加标回收试验，每个加标水平重复测定3次，计算回收率和相对标准偏差(RSD)，结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果 %

由表3可知，加标回收率为96.7%～104%，RSD为1.6%～2.7%，表明方法稳定，具有较高的精密度和较好的回收率。

3 结语

试验采用EC-C18色谱柱进行分离，二极管阵列检测器检测，以外标法定量，高效液相色谱法测定有机-无机复合肥料中4种抗生素的残留量。方法具有灵敏度高、准确度高、精密度好等优点，可以满足有机-无机复合肥料中4种抗生素的检测需求。