稳定同位素标记化合物在我国分析检测领域中的应用进展*

徐仲杰， 张 雨， 雷 雯， 胡祖明

(1.东华大学材料科学与工程学院化纤与高分子材料改性国家重点实验室 上海 201620；2.上海化工研究院有限公司技术开发中心 上海 200062)

近年来，随着同位素稀释质谱法在检测中的普遍应用，对作为其内标试剂的稳定同位素标记化合物的需求日益增长，促使稳定同位素标记技术迅猛发展。目前以代谢组学、蛋白质组学、临床质谱为代表的现代生物技术发展迅速，同时越来越多的生物技术引入医药产业，使得生物医药产业化进程明显加快。在生物工程、生命科学及新药研发等领域，以同位素示踪技术为核心的代谢组学获得广泛应用。

当前稳定同位素稀释质谱法在环境领域的应用日渐广泛，这是由于稳定同位素内标在特定环境污染源中的结构特殊，同时具有在迁移及反应过程中结构稳定、检测结果精密度高和准确度好等特点，已被大量应用于环境污染物来源分析以及环境污染事件仲裁。

十八大以来，我国为保障人民“舌尖上的安全”，进而更好地保证人体健康，对食品安全问题高度重视，将其提升到国家战略的高度。为响应国家发展战略，越来越多的检测标准、科学研究倾向于选择灵敏度高、准确性好的检测方法，应用于食品中农兽药残留、违禁添加剂等的检测，稳定同位素稀释质谱法以其独特的优势发挥了巨大的作用。

1 稳定同位素标记化合物在生物医药领域的应用

在生物医药领域，稳定同位素标记化合物主要作为示踪剂追踪生物体内能量、糖类、脂质等特定代谢通路，得到机理信息，或作为内标试剂应用于蛋白质准确定量及代谢相关疾病的诊断。

1.1 代谢组学

代谢组学是新兴组学技术，是在基因组学以及蛋白质组学后发展起来的。近年来，基于同位素示踪技术的代谢组学被广泛应用在生物工程、生命科学及药物研发领域。通过引入带有稳定同位素标记的示踪剂，追踪生物体内特定代谢通路及代谢物的情况，从而为合成生物学、疾病致病机理研究、药物代谢及作用机理研究提供依据。

付慧等[1]以氘或13C标记的稳定同位素标记化合物为内标，采用液液萃取-高分辨气相色谱-高分辨双聚焦磁质谱法对人体尿中8种多环芳烃代谢物同时进行定量分析，检测时加入的同位素内标试剂为1-羟基萘-D7、2-羟基芴-D9、3-羟基芴-D9、13C12-2,3,3′,4,4′-五氯联苯等，多环芳烃代谢物的检出限可达0.006～0.042 μg/L。

张秀尧等[2]以稳定同位素标记去甲地西泮-D5为内标，采用超高效液相色谱-串联质谱法对人血浆和尿液中42种精神药物及其代谢产物进行了快速准确检测，其中巴比妥类药物的检出限为20～100 mg/L，其余药物的检出限为0.05～2.0 mg/L。

朱婧等[3]以同位素标记苯巯基尿酸-D2、N-乙酰基-S-(1,2-二氯乙烯基)-L-半胱氨酸-13C,D3、N-乙酰基-S-苯基-L-半胱氨酸-13C6等为内标试剂，采用超高效液相色谱-串联质谱法测定尿中苯系物以及三氯乙烯代谢产物，方法的检出限低至0.035 0～1.75 μg/L。

陈跃等[4]使用甲基苯丙胺-D5、吗啡-D3、O6-单乙酰吗啡-D3为内标，利用超高效液相色谱-串联质谱法，对人体唾液中3种毒品(甲基苯丙胺、吗啡、O6-单乙酰吗啡)及其代谢物进行检测，3种毒品的检出限为0.02～0.05 μg/L。

王佳曼等[5]采用液相色谱-串联质谱法，以20种稳定同位素标记化合物做内标，对特应性皮炎患者中氨基酸、有机酸、脂肪酸等物质的代谢情况进行研究，所使用的内标包括12种氨基酸，分别为甘氨酸-15N，13C、丙氨酸-D4、缬氨酸-D8、亮氨酸-D3、蛋氨酸-D3、苯丙氨酸-D5、酪氨酸-13C6、天冬氨酸-D3、谷氨酸-D3、瓜氨酸-D2、鸟氨酸-D2、精氨酸-D4,13C；8种酰基肉碱内标，分别为游离肉碱-D9、乙酰肉碱-D3、丙酰肉碱-D3、丁酰肉碱-D3、异戊酰肉碱-D9、辛酰肉碱-D3、肉豆蔻酰肉碱-D9、棕榈酰肉碱-D3。

凌家俊等[6]以氘代尼古丁为内标，利用稳定同位素微透析采样技术，对尼古丁经皮制剂的整体及大脑局部的药代动力学进行了相关研究，为新型给药系统的体内过程研究提供了新的思路和研究方法。

杨旭等[7]以红霉素-D6为内标，使用液相色谱-串联质谱法，对血浆中琥乙红霉素及其活性代谢产物红霉素进行了同时测定，并在比格犬体内的药代动力学研究中也进行了应用，血浆中琥乙红霉素及红霉素的定量下限分别为4、2 ng/mL。

1.2 蛋白质组学

有定量蛋白质组学“化学标签”之称的稳定同位素(如2H、13C、15N和18O)标记的多肽及氨基酸，在生物样品的测试及示踪等领域的应用愈加普遍。由于稳定同位素特异肽段的理化性质与目标肽段完全一致，因此其色谱-质谱行为也一致，能有效校正由复杂的基质效应可能引起的检测响应值的波动。

杜鹃等[8]采用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法，对乳清蛋白粉中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白进行了测定，使用同位素特异肽VGI*NYWL*AHK和I*DAL*NENK作为内标，在预处理之前加到被测样品中。试验结果表明，选用同位素标记内标肽段不但能降低基质效应，还能校正样品前处理过程的误差。

胡蓓等[9]以同位素内标肽LSQSKVL*PV*PQK(L*：Leu-OH-13C6，15N；V*：Val-OH-13C5，15N)做内标，对婴幼儿配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量进行了定量分析，该方法的定量下限可达10 mg/kg。

任文华等[10]以13C、氘标记糖化赖氨酸及赖氨酸为内标，对血清糖化白蛋白进行测定。该方法在相关性、精密度、正确性等方面都优于常规酶法，被推荐为我国糖化白蛋白测定的候选参考方法。

李佳乐等[11]采用13C5-脯氨酸、13C9-苯丙氨酸、13C5-缬氨酸为内标，对人血清白蛋白纯品含量采用超高效液相色谱-同位素稀释质谱(HPLC-IDMS)测定。该方法作为纯品人血清白蛋白标准物质的定值方法，对保证临床检验中测定结果的量值溯源性具有重要的意义。

沈蕾等[12]以13C5-缬氨酸、13C9,15N-苯丙氨酸为内标，利用液相色谱-串联质谱法，成功实现人重组蛋白胱抑素C的准确定量。

齐开伦等[13]以同位素标记肽段做内标，对鸡蛋中3种主要致敏蛋白溶菌酶、卵转铁蛋白、卵白蛋白进行了超高效液相色谱-串联质谱检测。该方法用于测定烘焙食品中3种致敏蛋白，其定量限为0.4～10.0 μg/g。所使用的同位素标记特异肽段分别为：HG[13C-15N-L]DNYR、FESN[13C-15N-F]NTQATNR、GTDVQAW[13C-15N-I]R、KDSN[13C-15N-V]NWN-NLK、Y[13C-15N-F]GYTG-ALR、[13C-15N-I]RDLLER、AFKDEDTQAMP[13C-15N-F]R、LTEWTSSN[13C-15N-V]MEER、ISQA[13C-15N-V]HAAHAEINEAGR。

2 稳定同位素标记化合物在环境科学领域的应用

目前，以稳定同位素标记试剂为内标的同位素稀释质谱法已广泛应用于环境中抗生素残留、挥发性有机物、环境激素等的检测及相关研究；同时，由于同位素稀释质谱法在检测中的优势作用，我国针对环境中有害物质的检测所发布的一系列标准，越来越倾向于采用稳定同位素标记试剂做内标。

2.1 环境检测研究

陈磊等[14]以稳定同位素氘标记恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星为内标，采用QuEChERS前处理结合超高效液相色谱-串联质谱法，对土壤中19种氟喹诺酮类抗生素残留进行快速测定，方法检出限为0.2～1.0 μg/kg，操作简单，准确度高。

赵超群等[15]以磺胺地索辛-D6、磺胺喹噁啉-13C6、磺胺甲基嘧啶-13C6、磺胺甲噁唑-D4为内标，采用固相萃取净化富集结合超高效液相色谱-串联质谱法，对饮用水中17种磺胺类药物残留进行定量分析，17种磺胺类药物的定量限均低于0.025 3 μg/L。

曾玉珠等[16]采用固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术，测定了4种不同水体(地表水、废水、饮用水源水及生活用水)中6种环境激素类污染物——雌三醇、17-β-雌二醇、17-α-雌二醇、雌酮、炔雌醇、己烯雌酚的含量。该方法采用雌三醇-D3、17-β-雌二醇-D2、己烯雌酚-D8做内标，多反应监测模式进行分析，方法的定量限为1.08～1.78 ng/L。

刘星等[17]采用13C标记PCB28、PCB111、PCB178、PCB141做内标，利用气相色谱-三重四极杆质谱法，建立了海洋沉积物中28种痕量多氯联苯的检测方法，方法的线性范围为0.1～50 ng/mL，定量范围为0.009～0.052 μg/kg，方法的灵敏度高，抗干扰能力强。

秦威振等[18]建立了室内灰尘中5种有机磷酸酯阻燃剂的定量分析方法。该方法使用稳定同位素氘标记有机磷酸酯做内标，通过超声辅助提取，同时结合固相萃取的方式进行样品的前处理，利用高效液相色谱-串联质谱法进行检测，方法的检出限为1.8～36.0 ng/g，定量限为5.9～120.0 ng/g，所使用同位素内标分别为磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯-D15、磷酸三(2-氯丙基)酯-D18、磷酸三苯酯-D15等。

2.2 环境标准

目前，稳定同位素内标已广泛应用于环境中有害物质的检测，我国针对水质、土壤、固体废物、空气中有害物质的检测也发布了一系列的环境保护标准。近几年应用同位素内标进行有害物质检测的环境保护标准汇总见表1。

表1 应用同位素内标进行有害物质检测的环境保护标准汇总

3 稳定同位素标记化合物在食品安全领域的应用

在食品安全领域，稳定同位素标记内标试剂主要应用于农兽药残留检测，非法及滥用添加剂、迁移污染物、毒素等的检测。杜晓宁等[36]对同位素稀释质谱法在食品中有害物质检测的应用进行了综述，并介绍了其在检测以及国家或行业标准中的应用情况。

廖朝选等[37]采用同位素稀释超高效液相色谱-串联质谱技术，对豆制品中16种喹诺酮类药物残留进行了测定。该方法使用的同位素内标有诺氟沙星-D5、环丙沙星-D8、恩诺沙星-D5，16种喹诺酮类药物的检出限为0.5 μg/kg，平均回收率为80.7%～107.1%。

邱福保等[38]使用超高效液相色谱-串联质谱法，对谷物制品中18种真菌毒素进行了检测，方法的检出限和定量限分别为0.03～4 μg/kg和0.25～15 μg/kg，所使用的稳定同位素内标试剂分别为U-[13C17]-黄曲霉毒素B1、U-[13C17]-黄曲霉毒素B2、U-[13C17]-黄曲霉毒素G1、U-[13C17]-黄曲霉毒素G2、U-[13C17]-黄曲霉毒素M1、U-[13C20]-赭曲霉毒素A、U-[13C34]-伏马毒素B2、U-[13C34]-伏马毒素B3、U-[13C24]-T-毒素、U-[13C22]-HT-2毒素、U-[13C34]-伏马毒素B1、U-[13C15]-脱氧雪腐镰刀菌烯醇、U-[13C15]-3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇、U-[13C15]-瓜萎镰刀菌烯醇、U-[13C18]-玉米赤霉烯酮。

韩超等[39]采用同位素稀释气相色谱-串联质谱法，测定了动物源食品中克霉唑残留量。该方法使用克霉唑-D5做内标进行定量，校正了目标物的损失，提高了测量结果的稳定性和重复性，保证方法有较好的回收率和精密度。该方法灵敏度高、准确性好，定量限为2.0 μg/kg，回收率为82.6%～116.5%，相对标准偏差为5.2%～13.5%，能够满足猪肉、鸡肉、牛肉、鱼肉、猪脂肪、猪心、猪肝、猪肾中克霉唑残留量的确证和定量分析，为保障食品安全提供技术支持。

廖艳华等[40]以氘代甲醛DNPH-3,5,6-D3为内标建立了测定水产品中甲醛的检测方法，方法的检出限为1.0 μg/kg。

王艳等[41]建立了奶粉及保健食品中左旋肉碱含量的检测方法。该方法以左旋肉碱-D3为内标，样品经溶解、蛋白沉淀、超声提取、离心、过滤后，采用高效液相色谱-高分辨质谱法进行测定，使用同位素内标避免了外标法定量时基质的干扰，方法的检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.2 μg/kg。

毛思浩等[43]采用超高效液相色谱-串联质谱法同时结合全自动固相萃取技术，测定了蜂蜜中4种硝基呋喃代谢物。该方法以AMOZ-D5、AHD-13C3、AOZ-D4、SEM-15N213C1为内标定量，方法检出限为0.04～0.08 μg/kg，在0.25、1.25、2.50 μg/kg水平进行加标试验，平均回收率为100.6%～102.3%。

4 展望

由于同位素稀释质谱法在痕量分析中消除基质干扰方面具有独特的技术优势，在检测及科研中的应用日益广泛，对内标试剂的需求也随之飞速增长，目前国内检测及科研中所使用的稳定同位素标记内标试剂大多数从国外进口。随着我国对科研用高端试剂的日益重视，越来越多的拥有自主知识产权的稳定同位素标记试剂将进入市场，助力我国生物医药、环境科学、食品安全等领域的科研及检测工作。