“半夏⁃天南星”药对治疗肺癌的网络药理学研究

黄重铭，林秋平，彭慧婷，林晓彤，曹 洋

（1. 广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510405；2. 广州中医药大学附属东莞中医院，广东东莞 523000；3. 广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。流行病学研究显示，2014 年我国新发肺癌病例78.1万，同期肺癌死亡病例为62.6 万［1］。由于肺癌症状缺乏特异性，57%的肺癌患者初诊时已经发生了远处转移，失去手术切除的机会［2］。目前，手术、放疗、化疗、靶向治疗、免疫治疗等是肺癌主要的治疗方式。中医药是肺癌综合治疗的重要组成部分，在抑制肺癌增殖和转移，改善放化疗、靶向治疗及免疫治疗的毒副作用，提高患者的生存质量，延长生存期等多方面发挥重要作用［3］。

肺癌在中医可归属“息贲”、“肺壅”、“肺积”等范畴。古人对肺癌的症状、病因、病机已经有了较深入的理解，清代沈金鳌的《杂病源流犀烛》提出：邪积胸中，阻塞气道，气不宣通，为痰为食为血，皆得与正相搏，邪既胜，正不得而制之，遂结成形而有块。可见肺癌是由于正气亏虚，邪毒侵肺，肺气宣降不利，血行瘀滞，津失输布聚而成痰，痰瘀毒结聚而成［4］。“痰”、“瘀”、“毒”、“虚”是肺癌的基本病机，肺癌与“痰”关系密切［5］。国医大师周岱翰教授将肺癌分为肺郁痰瘀、脾虚痰湿、阴虚痰热、气阴两虚等4 个证型，在治疗上将化痰散结贯穿始终［6］。邓铁涛教授治疗肺癌的经验方“金福安汤”，以及周岱翰教授治肺癌经验方“星夏涤痰汤”和“星夏健脾饮”，均以生半夏和生南星为君药。

半夏为天南星科植物半夏的干燥块茎，《本草经集录》谓其“主消心腹胸中膈痰热满结，咳嗽上气，心下急痛坚痞，时气呕逆，消痈肿”，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效；天南星为天南星科多年生本草植物天南星的干燥块茎，《开宝本草》谓其能“除痰，下气，破坚结，消痈肿”，具有燥湿化痰，祛风止痉，散结消肿的功效［7］。李芬芳等［8］通过构建Lewis 肺癌小鼠模型，观察生半夏、生南星对皮下肿瘤体积，瘤体质量的影响，结果表明生半夏-生南星能抑制小鼠Lewis 肺癌的生长。然而，目前针对半夏-天南星药对治疗肺癌的相关研究较少，其作用机制尚不明确，本研究运用网络药理学的方法，筛选半夏-天南星治疗肺癌的活性成分和关键靶点，并对其关键机制进行分析和预测，为今后更深入的研究提供思路和借鉴。

1 材料与方法

1.1 “半夏-天南星”药对活性成分的筛选

中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）收录了2010 版《中国药典》所载的499 味中药，涉及化学成分29 384种［9］。口服生物利用度（OB）和类药性（DL）是评价药代动力学的重要参数。检索“半夏”、“天南星”的相关化学成分，以OB≥30%，DL≥0.18 作为潜在活性成分的筛选条件，收集符合条件的活性成分。

1.2 靶点的收集

通过TCMSP 平台查询活性成分的靶点信息，将靶点分别输入Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/），限定物种来源为人类，查询靶点蛋白的基因名。以“lung cancer”为检索词检索DisGeNet数据库（https：//www.disgenet.org/），获得肺癌相关靶点。

1.3 “药物-活性成分-靶点”网络的构建

将“药物-活性成分”、“活性成分-靶点”相互关系整理成Excel 文件导入cytoscape3.7.0，构建“药物-活性成分-靶点”网络图，分析网络拓扑参数，对“半夏-天南星”关键成分进行筛选。

1.4 蛋白互作网络（PPI）的构建与分析

使用cytoscape3.7.0 的BisoGenet 插件分别构建“活性成分作用靶点PPI 网络”和“肺癌靶点PPI 网络”。通过”Mergre”功能对两个PPI 网络取交集，获得交集网络。分别使用“analyze network”功能和CytoNCA 插件对网络拓扑参数进行分析，分析内容包括自由度（degree）、介度中心性（BC）和接近中心性（CC）等。通过Degree、BC、CC 等指标筛选关键靶点，并从关键靶点中筛选出与活性成分和肺癌直接相关的靶点作为核心靶点。

1.5 分子对接验证

从ZINC 数据库（http：//zinc.docking.org/）查询“1.3”中关键成分的结构，并保存为mol 格式。从PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）下载核心靶点的3D 结构，保存为PDB 格式，使用PyMol 软件删除蛋白结构的水分子和小分子配体，并导入AutoDockTools 进行加氢等预处理。将活性成分和靶点蛋白均转换成pdbqt 格式文件。最后运行AutoDockTools 对活性成分和靶点蛋白分别进行对接，保存最低结合能数据作为分子对接的结果。结合能＜0 提示活性成分可与靶点蛋白自发结合。结合能越低，表明活性成分与靶蛋白的结合力越强。结合相关文献，一般认为结合能≤-5.0 KJ/mol 的药物分子与靶点具有较好的结合活性［10］。

1.6 GO 生物过程及KEGG 通路富集分析

DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）能够对给定基因或蛋白质的生物学意义进行系统分析［11］。将“1.4”中筛选得到的关键靶点上传至DAVID 数据库，

GO 分析时选择生物过程（BP）模块，通路分析选择KEGG 模块。筛选FDR＜0.05 的GO 生物过程和P＜0.01 的KEGG 富集结果。通过OmicShare平台（https：//www.omicshare.com/）对分析结果进行可视化。

2 结果

2.1 “半夏-天南星”药对活性成分的筛选

通过检索TCMSP 数据库，共收集到半夏化学成分116 个，天南星化学成分122 个。设定筛选条件OB≥30%，DL≥0.18，对具有较高活性的化学成分进行筛选，共得到活性成分18 个，其中半夏活性成分13 个，天南星活性成分7 个（表1）。半夏和陈皮共有活性成分2 个，分别为β-谷甾醇和豆甾醇。

表1 “半夏⁃天南星”药对活性成分Tab 1 Active components of drug pair "Pinelliae rhizoma- Arisaematis rhizoma"

2.2 靶点的收集

使用TCMSP 数据库收集活性成分对应的靶点。由于半夏活性成分12，13-epoxy-9-hydroxynonadeca-7、黄芩苷和天南星活性成分8，11，14-Docosatrienoic acid 无对应靶点信息，故予剔除。15 个活性成分共收集到100 个作用靶点，通过Uniprot 数据库标准化后共获取92 个靶点。通过DisGeNet 数据库检索肺癌相关靶点，设定检索词为“lung cancer”，共收集到347 个肺癌相关靶点。

2.3 “药物-活性成分-靶点”网络的构建

将“半夏”、“天南星”所对应的15 个活性成分、92 个靶点的相互关系导入cytoscape3.7.0，绘制“药物-活性成分-靶点”网络（图1）。网络图中共包括108 个节点，182 条边。网络中黄色节点代表药物，红色节点代表活性成分，蓝色节点代表靶点。网络拓扑分析提示：β-谷甾醇（degree=36）、黄芩素（degree=34）、豆甾醇（degree=31）等3 种活性成分能与30 个以上的靶点连接，卡文定碱（degree=24）和松柏苷（degree=21）2 种活性成分能与20 个以上靶点连接，因此可认为上述5 个活性成分是“半夏-天南星”药对的主要活性成分。

图1 “药对-活性成分-靶点”网络Fig 1 "Drug pair⁃active components⁃targets" network

2.4 蛋白互作网络的构建与分析

通过BisoGenet 插件对347 个肺癌相关靶点构建PPI 网络，获得与肺癌直接或间接相关的作用靶点8 212 个，相互关系189 594 条；对活性成分作用的92 个靶点构建PPI 网络，获得活性成分直接或间接作用靶点3 604 个，相互关系89 187 条。将2 个PPI 网络取交集得到1 个由3 442 个靶点，87 520 条相互关系的网络。筛选交集网络的关键靶点，筛选策略见图2。在交集网络中，degree 的中位数为30。筛选出degree≥60 的子网络包含886 个靶点和38 481 个靶点与靶点的相互关系。由于靶点数量较多，故对子网络进行二次筛选。子网络的degree、BC、CC 的中位数分别为101、5.62×104、0.449，选择degree≥202、BC≥5.62×104、CC≥0.449 的靶点作为关键靶点，最终得到关键靶点95 个，靶点间相互关系1 704 条。95 个关键靶点中有11 个靶点与活性成分和肺癌均直接相关，分别为：ESR1（degree=764）、CDK2（degree=689）、AR（degree=348）、AKT1（degree=340）、RELA（degree=311）、JUN（degree=283）、PRKCA（degree=275）、ADRB2（degree=260）、FOS（degree=217）。选取degree 值最高的2 个靶点作为药对治疗肺癌的核心靶点（图3），分别为ESR1 和CDK2。

图2 交集网络关键靶点的筛选Fig 2 Screening of key targets of intersection network

图3 PPI 网络关键靶点的degree 值Fig 3 Degree value of key targets of PPI network

2.5 分子对接验证

将“2.4”中筛选得到的核心靶点（ESR1 和CDK2）与“半夏-天南星”药对5 个主要活性成分进行分子对接，由表2 可知，ESR1 与β-谷甾醇、豆甾醇、卡文定碱和松柏苷有较好的结合活性；CKD2 与β-谷甾醇、豆甾醇和卡文定碱有较好的结合活性。其中ESRI 与豆甾醇（图4）、CKD2 与卡文定碱（图5）的结合力较好，为靶蛋白与活性成分的最佳组合。分子对接结果表明，半夏-天南星药对的活性成分可以对核心靶点发挥调控作用。

表2 分子对接结果（kJ/mol）Tab 2 Molecular docking results（kJ/mol）

图4 ESR1 与Stigmasterol 对接Fig 4 Docking between ESR1 and stigmasterol

图5 CDK2 与Cavidine 对接Fig 5 Docking between CDK2 and cavidine

2.6 GO 生物过程及KEGG 通路富集分析

GO 生物功能分析结果表明，关键靶点主要涉及基因表达与转录的调控、凋亡过程的调控、蛋白质代谢、药物反应等多个生物过程，表明半夏-天南星药对可通过多个生物过程发挥治疗肺癌的作用。图6 展示显著程度前20 的GO 生物功能富集结果。KEGG 通路富集分析表明，关键靶点富集在63 条通路上，剔除广泛通路后共获得21 条信号通路（图7）。

图6 排名前20 的GO 生物过程Fig 6 Top 20 GO biological processes

图7 KEGG 通路富集分析Fig 7 KEGG pathway enrichment analysis

3 讨论

本研究从半夏-天南星药对中筛选得到15 个活性成分和92 个活性成分作用靶点。通过分析“药物-活性成分-靶点”网络，推测β-谷甾醇、黄芩素、豆甾醇、卡文定碱和松柏苷等5 个成分是“半夏-天南星”治疗肺癌的主要活性成分。β-谷甾醇和豆甾醇是半夏和天南星的共有活性成分。有研究表明，β-谷甾醇可显著抑制A549 和NCI-H460 细胞的生长，诱导细胞周期的停滞与调亡，但不损害正常细胞［12］。豆甾醇在体外实验中对黑色素瘤、肝癌、胆管癌、胃癌、皮肤癌等多种肿瘤细胞具有抑制作用，其机制涉及上调调亡基因的表达，诱导细胞周期阻滞、破环肿瘤血管的生成等［13］，但目前尚无针对肺癌的研究报道。黄芩素、卡文定碱和松柏苷是来自半夏的活性成分。黄芩素可下调VEGF、FGFR-2和RB-1 表达以抑制肿瘤血管生成［14］；通过抑制PTEN / PI3K / Akt 途径增加NSCLC 对顺铂的敏感性，提高顺铂的疗效［15］。卡文定碱和松柏苷的相关研究较少，但本研究发现卡文定碱和松柏苷能与较多靶点连接，并且与核心靶点有较好的对接活性，提示这两个活性成分具有潜在抗癌活性，值得进一步研究。在这5 个主要活性成分中，归属于半夏的活性成分有5 个，归属于天南星的活性成分有2个，说明半夏-天南星药对在肺癌的治疗中，半夏起主要的作用，天南星与半夏配伍可以增强半夏的疗效。因此，从网络药理学的角度推测半夏-天南星药对符合“相使”的配伍特点。

PPI 网络中筛选出ESR1 和CDK2 作为核心靶点。分子对接发现核心靶点与大部分主要活性成分有较好的对接活性，说明半夏-天南星药对的活性成分能对核心靶点发挥调控作用。 雌激素受体（ER）主要分为两个亚型，即雌激素受体α（ESR1）和雌激素受体β（ESR2）。 ESR1 主要存在于NSCLC 细胞的细胞质中［16］。雌激素与雌激素受体结合后，可以通过辅助活化因子诱导相关基因的表达，加速细胞增殖和迁移；或通过激活MEK/ERK通路、PI3K/AKT 通路、cAMP/PKA 通路，从而发挥抑制调亡，加速增殖及肿瘤新生血管生成的作用［17］。由于雌激素受体通路与EGFR 通路存在部分相同的下游通路，因此雌激素还可活化EGFR，促进细胞生长增殖［18-19］。CDK2 是细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的主要成员之一，其主要作用是促进细胞周期时相的转变［20］。目前，在胃癌、肠癌、肺癌等多种肿瘤中均有CDK2 异常表达的报道，有研究发现，在NSCLC 中CDK2 的表达显著提高，且CDK2 的异常表达与肺癌分化程度、淋巴结转移具有相关性［21］。

GO 生物功能分析结果发现，关键靶点主要涉及基因表达与转录的调控、凋亡过程的调控、蛋白质代谢、药物反应等多个生物过程。对21 条KEGG信号通路进行分析，发现半夏-天南星治疗肺癌的主要信号通路可大致分为3 类：（1）调控细胞周期：PI3K-Akt 信号通路是抑制细胞凋亡的主要通路途径，该通路的活化可以促进Bcl-2、caspase、FOXOs磷酸化抑制肺癌细胞凋亡，激活mTOR、CDKs、核转录因子NF-κB 发挥促进肺癌细胞增殖、阻滞细胞周期、抑制细胞凋亡的作用［22］。肿瘤耐药与细胞凋亡的抑制有关，PI3K-Akt 信号通路抑制剂可减少化疗抵抗［23］。TGF-β 信号通路与Hippo 信号通路均参与细胞周期的调控［24，25］。核心蛋白聚糖可下调EGFR 表达，活化MAPK，上调p21 表达，抑制TGF-β 的活性，进而抑制肺癌细胞增殖［26］。（2）调控血管生成：HIF-1 在细胞缺氧时可促进VEGF 的表达，诱导肿瘤血管生成，增加血管的通透性，与肿瘤生长、浸润和转移密切相关［27］。肿瘤坏死因子（TNF）主要以TNF-α 的形式存在，TNF-α 参与诱导肿瘤血管损伤、抑制血管生成，从而引起肿瘤组织出血坏死［28］。（3）调控肿瘤干细胞：肿瘤干细胞是肿瘤组织中小部分具有干细胞性质的细胞亚群，在肿瘤的复发、转移、耐药中起着重要作用。Wnt 信号通路和Notch 信号通路与肺癌干细胞的自我更新关系密切，靶向抑制上述通路可导致肿瘤干细胞凋亡［29］。

本研究运用网络药理学的方法，对半夏-天南星药对治疗肺癌的作用机制进行探究，同时采用分子对接方法对核心靶点与关键成分进行对接验证，间接证实了本研究的预测的准确性和可靠性。半夏-天南星药对通过β-谷甾醇、黄芩素、豆甾醇、卡文定碱和松柏苷等活性成分，调节ESR1、CDK2 等相关靶点的表达，进而干预PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、FoxO、TGF-β、Hippo、TNF、Notch、VEGF、cAMP等多条肺癌相关通路，从调控细胞周期、调控血管生成、调控肿瘤干细胞等多个方面发挥治疗肺癌的作用。半夏-天南星药对治疗肺癌的作用机制体现了中药多成分、多靶点、多通路的特点，本研究可为后续进一步研究提供思路和借鉴，也为临床应用提供一定的依据。