右归饮对糖皮质激素诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的调节作用

陈 浩，袁 鹏，孙 浩，高飞飞，陈 阳，刘 锌，杜 斌

（1.南京中医药大学附属医院，江苏南京 210012；2.江苏省中医院骨伤科，江苏南京 210029）

激素性股骨头坏死（glucoticorticoid-associated osteonecrosis of the femoral head，GA-ONFH）是一种因长期或大剂量应用激素导致股骨头不可逆塌陷、髋关节功能障碍的疾病［1］，具有呈渐进性发展、预后差、致残率高［2，3］的临床特点。GA-ONFH 的确切发病机制尚无定论，最新研究［4］表明糖皮质激素（glucocorticoids，GCs）通过诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的凋亡从而降低其增殖，引起细胞的成骨分化能力减弱、成脂分化增强，进而导致骨修复不足。这也是GA-ONFH 的发生发展的重要机制之一。因此，恢复BMSCs 成骨和成脂分化之间的平衡对GA-ONFH 的治疗至关重要。

中医理论认为，肾主骨生髓，肾中所含先天之精是人体生命活动的物质基础，对骨骼的强健起主宰作用。长期或大剂量使用GCs 伤及肾精，致五脏六腑失养、气血生化乏源，血行推动无力而成瘀，髓海瘀滞，髓死骨枯，发为本病。此类患者的肾上腺皮质激素及甲状腺激素轴被抑制，因此常伴有畏寒、无力、皮肤苍白、食欲减退等肾阳虚证的临床表现［5］。右归饮以“阴中求阳”立法，温补命门之火，常用于肾阳亏虚之证。多项研究［6］表明，右归饮能通过调节骨代谢发挥对GA-ONFH 的治疗作用。本实验通过对大鼠BMSCs 进行体外实验，观察右归饮含药血清对BMSCs 凋亡相关蛋白、成骨指标的影响，并对靶点蛋白进行分子对接以明确右归饮的作用机制，以期发现该方治疗GA-ONFH 的现代医学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD 大鼠20 只，体质量200～250 g，6 周龄，购自南京浦口区莱芙养殖场［动物生产许可证号：SCXK（苏）2019-0005］，饲养于南京中医药大学动物实验中心。该研究经过南京中医药大学附属医院动物伦理委员会批准。

1.2 药品及实验试剂

右归饮药物组成：熟地黄30 g，山药、肉桂、姜杜仲、枸杞子、炙甘草各6 g，山茱萸、制附子各3 g，中药饮片由江苏省中医院中药房提供；抗兔Bcl-2（Bcl-2 Rabbit Polyclonal antibody；26593-1-AP）、抗兔Bcl-2 相关X 蛋白（BAX Mouse Monoclonal antibody；60267-1-lg）购自Protientech 公司；抗兔半胱氨酸蛋白酶3［Caspase-3（D3R6Y） Rabbit mAb；14220］购自CST 公司；胎牛血清（10091148）、青霉素-链霉素（15140122）购自赛默飞世尔科技有限公司；SD 大鼠骨髓间充质干细胞成脂（RASMX-90031）、成骨（RASMX-90021）诱导分化培养基（赛业生物科技集团）；苏木精、伊红（四季青公司）；大鼠骨碱性磷酸酶ELISA 试剂盒（上海臻科生物科技有限公司）；茜素红、油红O 染液、噻唑蓝、二甲基亚砜、Percoll（南京碧云天生物有限公司）；P53、LC3Ⅱ抗体、辣根过氧化物酶（Cyagen 公司）。

1.3 主要仪器

倒置相差显微镜（上海光学仪器厂）；Image-pro plus 6.0（IPP）；恒温恒湿孵育箱（Heraeus 公司）；蛋白交互仪（Beckman 公司）；Mini Electrophoresis System 电泳仪（BIO-RAD 公司）；转膜及成像系统（Beckman 公司）；激光共聚焦显微镜（ZEISS公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 含药血清的制备 按照随机数字表法将大鼠平均分为2 组：生理盐水组、右归饮组。右归饮按照灌胃剂量公式［7］：200（mL）÷人类平均体质量（kg）×大鼠实际体质量（kg）×倍增系数，按人类平均体质量70 kg，倍增系数为1 换算后进行灌胃，生理盐水组给予每日8 mL/kg 生理盐水灌胃，均为1次/d。连续灌胃2 周，末次灌胃1 h 后脱脊处死，腹主动脉取血，室温下静置2 h，离心取上层血清，灭活、过滤、分装，-80 ℃保存。

1.4.2 细胞提取与分组 大鼠脊椎脱臼，无菌条件下分离大鼠双侧股骨和胫骨，剪开干骺端后用培养基反复冲洗髓腔，细胞过滤器过滤，1 000 r/min 离心8 min，弃上清。加入完全培养基（15% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素+100 μg/mL 链霉素、1 mmol/L 的L-谷氨酰胺）吹成细胞悬液接种于培养瓶内，2 d 后换液，倒置显微镜下观察。当细胞融合达70%～80%时用0.25%的胰蛋白酶消化细胞传代，取生长良好的第2 代BMSCs，以4.0×105/mL 培养液种于25 cm2培养瓶中，根据文献报道进行实验分组及给药［8-10］：空白组：10%空白血清；模型组：10% 空白血清+地塞米松5×10-5mol/mL；中药组：10%含药血清+地塞米松5×10-5mol/mL；对照组：10%含药血清。

1.4.3 细胞增殖情况检测 采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测各组细胞增殖变化。将BMSCs 接种于4 块96 孔板中，1 d 后细胞贴壁取出一块检测，之后以2 d 为1 个周期，每天取出一块96 孔板，吸取培养基，每孔加入10%的CCK8 溶液100 μL，38 ℃孵育2 h，酶标仪450 nm 检测吸光度，计算平均值。绘制细胞的生长曲线。

1.4.4 成骨分化指标检测 使用成骨诱导培养基对各组BMSCs 进行成骨诱导培养，2 d 后使用骨ALP ELISA 试剂盒进行检测，设置标准孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL；样本孔加各组培养基10 μL，再加样本稀释液40 μL。加入辣根过氧化物酶100 μL，封膜，37 ℃孵育1 h，弃去液体，拍干，洗涤5 次，加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加入终止液50 μL，ELISA 监测仪检测各孔450 nm 波长的吸光度值，根据标准品计量。21 d 后，以茜素红染色30 min，200 倍镜下随机选取3 个视野，比较各组红染钙矿化结节数量。

1.4.5 Western blot 检测BMSCs 凋亡相关蛋白表达 细胞分组干预后，待细胞融合达90%后进行蛋白提取，吸出培养基，PBS 冲洗3 遍，并完全吸干，每孔加入100 μL 细胞裂解液（1% 苯甲基磺酰氟和10%磷酸酶蛋白酶抑制剂）。15 min 后，用刮板将细胞刮下，超声裂解25 s，重复3 次。细胞充分裂解后12 000 ×g在4 ℃离心20 min 后取上清，BAC 法测蛋白浓度。加入6×上样缓冲液混匀后煮沸。电泳板安装好后制作凝胶，并在上面的样品孔中加样。然后在恒压下进行电泳。电泳后，用聚亚乙烯基二氟化物膜0 ℃恒流转膜。5%的脱脂奶粉室温下封闭1 h。之后按条带剪开，一抗caspase 3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）和Bax（1∶5 000）在4 ℃下孵化过夜。次日，用TBST 冲洗3次，再用二抗在室温下孵育1 h，并再次清洗3次。最后，添加显影液，对条带进行可视化。然后对显影带进行灰度扫描，并对数据进行分析。β-actin作为内参，Image J软件对印迹进行定量分析。

1.4.6 分子对接 根据既往右归饮质谱结果［11］，对量丰成分进行通过Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库检索，获得3D 化合物结构，运用 Swisstarget（http：//www. swisstargetprediction.ch/）数据库预测其药代动力学（ADME），以胃肠吸收率（GI absorption）为High 和类药性（Drug likeness）＞0.18 为筛选标准。通过Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）和RCSB PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）查找Bcl-2、Bax、caspase 3的PDB ID，与筛选后的量丰成分前2 位进行对接，根据结合能评价靶点与活性化合物的结合强度与活性。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 BMSCs 形态学观察

48 h 换液后可见BMSCs 贴壁生长，呈纺锤形、椭圆形分布。培养3～7 d 后，细胞形态均一，呈长梭形，少量呈三角形集落生长（图1）。

图1 BMSCs 镜下观察（×200）Fig 1 BMSCs under microscope（×200）

2.2 细胞增殖结果

对比各组不同时间点的吸光度（A450）比值，模型组较空白组均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；而中药组、对照组较模型组均提高，差异有统计学意义（P＜0.05），对照组与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组BMSCs 生长情况（±s）Tab 1 BMSCs growth in each group（±s）

表1 各组BMSCs 生长情况（±s）Tab 1 BMSCs growth in each group（±s）

注：生长情况以各组吸光度（A450）比值表示；与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

7 d 0.97±0.14 0.59±0.10*0.81±0.10#0.96±0.13#27.548＜0.01组别空白组模型组中药组对照组FP 1 d 1.15±0.13 0.56±0.09*0.97±0.12#1.13±0.14#63.405＜0.01 3 d 1.04±0.16 0.53±0.11*0.88±0.13#1.04±0.12#40.977＜0.01 5 d 1.02±0.11 0.52±0.07*0.78±0.09#1.02±0.12#74.470＜0.01

2.3 成骨诱导结果

各组BMSCs 成骨诱导2 周后，模型组ALP水平（73.96±3.02）显著低于空白组（132.32±4.01）和对照组（131.74±3.18），差异有统计学意义（P＜0.05）；相较于模型组，中药组ALP 水平显著提高（108.67±4.78），差异有统计学意义（P＜0.05），对照组与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。各组BMSCs 成骨诱导后进行茜素红染色标定钙结节。模型组与各组相比，红染钙结节数量均显著降低；对照组与空白组无显著差异，两组均高于模型组与中药组，见图2。

图2 各组茜素红染色情况（×200）Fig 2 Alizarin red staining in each group（×200）

2.4 BMSCs 凋亡蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组促凋亡蛋白Bax 和cleaved caspase 3 的表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达水平则显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；中药组的Bax 和cleaved caspase 3 的表达水平较模型组显著降低，Bcl-2 的表达水平显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。对照组Bcl-2、Bax 和cleaved caspase 3 的表达水平与空白组相比无明显变化，见图3 及表2。

表2 各组蛋白印迹结果（±s）Tab 2 Western blot results in each group（±s）

表2 各组蛋白印迹结果（±s）Tab 2 Western blot results in each group（±s）

注：蛋白印迹定量结果以各组灰度值与actin 的比值表示；与空白组比较，△P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

cleaved caspase 3 0.755±0.106 1.846±0.015△0.330±0.104#0.335±0.105#184.823＜0.01组别空白组模型组对照组中药组FP Bcl-2 1.921±0.438 1.064±0.054△2.458±0.440#2.092±0.007#10.765＜0.01 Bax 0.155±0.022 1.031±0.223△0.321±0.069#0.362±0.113#26.420＜0.01

图3 各组蛋白表达Fig 3 The expression of proteins in each group

2.5 分子对接结果

对量丰成分进行筛选后结果（表3），选取峰值前2 为epicatechin 5，7，3'-trimethyl ether、delphinin与受体蛋白Bcl-2（PDB 编码：5vau）、Bax（PDB 编码：2k7w）、Caspase 3（PDB 编码：5i9B）进行分子对接，结果见图4、5，能量越低，分子亲和度越好，见表4。

表3 筛选后成分表Tab 3 List of components after screening

表4 分子对接结合能（kcal/mol）Tab 4 Molecular docking binding energy（kcal/mol）

图4 Delphinin 与靶点的对接模型Fig 4 Docking model of delphinin and target

图5 Epicatechin 5，7，3'-trimethyl ether 与靶点的对接模型Fig 5 Docking model of epicatechin 5，7，3'-trimethyl ether and target

3 讨论

凋亡是指机体为清除衰老或有害细胞、维护内环境稳定，通过线粒体凋亡途径和死亡受体（Fas-FasL）介导途径，引发有核细胞程序性死亡的过程［12］。

作为细胞死亡通路的整合元件，线粒体在细胞凋亡过程中扮演重要角色，由线粒体介导的细胞凋亡途径被称为caspase-9 途径。线粒体渗透性转变孔道复合物（permeability transition pore composite，PTPC）是一种由外膜蛋白电压依从性阴离子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）、腺嘌呤核苷酸易位体（adenine nucleotide translocase，ANT）、胞溶质蛋白D（cyclin D）等组件构成［13］的大分子、多蛋白复合体，当机体出现衰老或有害细胞时，线粒体内膜首先出现渗透性改变（permeability transition，PT），基质、胞浆内离子藉由PTPC 的开放得以流动，继而引发跨膜电位的下降及线粒体外膜的去极化。在dATP/ATP 的协助下，释放进入胞浆的细胞色素C 与Apaf-1 结合、寡聚化，并募集、活化和释放caspase-9 前体，启动caspase 级联反应，激活caspase-3、caspase-6、caspase-7 等下游分子，最终引起细胞凋亡［14］。上述途径也是Bcl-2 蛋白家族调控细胞凋亡的主要途径。当PTPC 开放时，Bcl-2能够在线粒体外膜形成离子通道，平衡其介导的跨膜离子流动，调节线粒体跨膜电位，阻止PTPC 的进一步开放，继而阻断细胞凋亡途径。此外，Bcl-2 还能提高线粒体膜的稳定性，阻止促凋亡蛋白的释放，对细胞功能发挥重要的保护作用［15］。

基于“肾主骨生髓”理论，右归饮被广泛应用于肾阳不足导致的骨伤科疾病。全方取“阴中求阳”之义，在肉桂、附子温肾助阳，补命门之火的同时，以山药、山萸肉、熟地益肾填精滋阴，使阳得阴助而生化无穷；辅以杜仲、枸杞补益肝肾，甘草调和诸药，共奏补肾助阳、壮骨生髓之功。多项研究也证实了右归饮具有调节脂质代谢、平衡成骨细胞与破骨细胞的形成分化的作用，从而发挥防治GA-ONFH 的功效。范连霞等［16］使用右归饮含药血清体外干预成骨细胞，检测ERK、β-catenin 和Runx-2 的蛋白表达，发现右归饮能通过ERK、Wnt 信号通路显著增加成骨细胞活性；吴承亮等［17］发现右归饮可抑制股骨头髓腔内骨髓脂肪化，可能通过拮抗GCs 诱导骨髓基质细胞成脂分化，促进GA-ONFH 的成骨修复。

Bcl-2 和Bax 的失衡是GCs 诱导BMSCs 凋亡的重要原因［18］。促凋亡蛋白Bax 能与ANT、VDAC 的结合，促进PTPC 的开放［13］，而Bcl-2 可通过与Bax竞争性结合ANT，或直接阻止Bax 与ANT、VDAC的结合来发挥其抗凋亡效应。本研究发现，中药组的Bax、cleaved caspase 3 蛋白表达降低，Bcl-2 表达增加，右归饮含药血清明显促进了经GCs 诱导的BMSCs 的增殖，对GCs 诱导的细胞凋亡起到了保护作用。此外，相较于模型组，中药组BMSCs 成骨发育潜力更强。分子对接结果表明，右归饮主要通过epicatechin 5，7，3'-trimethyl ether、delphinin 等调控BMSCs 凋亡，促进成骨。

综上所述，右归饮可能通过调控GCs 诱导的BMSCs 的凋亡，发挥对GA-ONFH 的治疗作用。但是本次实验仅进行了成骨诱导，未行成脂、成软骨诱导，缺少对间充质干细胞分化潜力的全面研究；对于凋亡，仅进行了蛋白表达的测定，未进行流式细胞凋亡检测等其他实验验证，并且其相关上游通路有待进一步探究。

作者贡献度说明：

陈浩：进行实验操作及数据分析，论文成文与修改；杜斌：课题项目的总策划人与总负责人，保障课题成功进行，论文修改者；刘锌：协助通讯作者实施课题，协助第一作者进行动物饲养及实验操作，协助数据处理；袁鹏：协助动物饲养及实验操作，协助数据分析；孙浩：协助数据分析及图表制作；高飞飞：协助实验操作、数据分析；陈阳：协助实验操作、数据分析。