葫芦茶苷保护活性氮诱导内皮细胞线粒体损伤的作用研究

黄巧凡，吴昊霖，徐怡倩，樊好飞，2，方星悦，王爱萍，虞道锐，孟庆雯，刘启兵，2

（1. 海南医学院基础医学与生命科学学院药理学教研室，海南海口 571199；2. 海南省热带脑科学研究与转化重点实验室，海南海口 571199）

血管内皮细胞具有维持血管张力、参与凝血、调节血管通透性等多种生理功能［1］。活性氮（reactive nitrogen species，RNS）介导的内皮细胞凋亡可导致内皮功能障碍的发生，可能是动脉粥样硬化、高血压、血管炎症等多种心血管疾病的早期事件之一［2］。内皮功能障碍的早期表现之一是线粒体功能和生物发生的失调。线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species，mtROS）的不平衡和广泛形成导致内皮功能障碍，这一过程反过来又加速了活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生［3］。最近的报告表明，ROS/RNS 介导的内皮细胞损伤与细胞线粒体损伤有关［2，4］。S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）是一种细胞RNS 损伤模型药物，被广泛用作一氧化氮供体，可引起线粒体的损伤，导致细胞凋亡［5］。目前研究表明，其主要通过介导RNS 的大量释放进而促进过量ROS 的出现致使细胞凋亡［6］。因此，保护线粒体有助于对抗细胞线粒体中的氧化损伤，维持氧化还原平衡有助于减弱受损进程。葫芦茶苷（tadehaginoside，THS）是葫芦茶活性成分之一［7］。近年来研究发现THS 在体内具有降血糖、抗炎等生物活性［8，9］，但对内皮细胞损伤的保护作用研究较少，且作用机制有待阐明。本研究采用高浓度活性氮GSNO（0.5 mmol/L）诱导内皮细胞损伤模型，探讨THS 对内皮细胞线粒体损伤的保护作用，为中草药葫芦茶的进一步开发提供科学依据。但是THS 如何介导分子信号通路仍然很不清楚。本研究旨在探讨GSNO 对内皮细胞线粒体的损伤机制以及THS 对内皮细胞线粒体基因的潜在益处，为保护血管内皮、预防RNS 损伤提供一种潜在保护策略。

1 材料与方法

1.1 实验材料

EA.hy 926 细胞系购自中科院上海细胞库。所有细胞均在37 ℃，含5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。GSNO（自提，纯度≥95%）、THS（自提，纯度≥95%）、DMEM 培养基（Gibco）、胎牛血清（FBS，Gibco）和青-链霉素（P/S，Gibco）。

1.2 仪器

荧光显微镜（Carl Zeiss AG）；全波长酶标仪（Thermo）；离心机（Thermo）；超微量分光光度计（NanoPhotometer）；多功能凝胶成像仪（GE）；实时荧光定量PCR 仪（ABI）。

1.3 方法

1.3.1 Western blot 分析 将EA.hy 926 细胞接种于7 个60 mm 培养皿中，细胞聚合至60%，加入终浓度为0.5 mmol/L GSNO 的DMEM 完全培养基分别损伤0、1、2、4、8、12、24 h，配置RIPA 裂解液（PAPI：PMSF=100∶1），12 000 r/min 离心10 min，通过BCA 蛋白定量试剂盒（Thermo）进行蛋白定量，用SDS-PAGE 分离各组EA.hy 926 细胞蛋白质30 μ L，转移到PVDF 膜上。用5% 脱脂牛奶封闭后，将膜与4 ℃的一抗孵育过夜。样品洗涤后与二抗（1∶5 000）在37 ℃下孵育2 h。本实验所用抗体如下，anti- BAX（1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology）、anti-Bcl-2（1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology）、anti-β-actin（1∶5 000，碧云天），用ECL化学发光试剂盒（碧云天）在多功能成像仪中显影采集蛋白条带。

1.3.2 MTT 法检测THS 细胞毒性 将细胞以105/mL 细胞/孔的密度接种于96 孔板中。分别加入THS 终浓度分别为0、5、10、20、40、80、160 μmol/L的DMEM 完全培养基孵育12 h，每种浓度梯度设3个复孔。

每孔加入20 μL MTT 染料溶液（5 mg/mL），并在37 ℃下孵育4 h。去除上清液，并用150 μL DMSO 溶解底部紫色沉淀。摇床孵育15 min，在490 nm 波长处测定各孔吸光度值。

1.3.3 MTT 法检测THS 保护作用 分别加入THS 终浓度为0、5、10、20、40、80、160 μmol/L 的DMEM 完全培养基37 ℃孵育1 h，然后每孔加入终浓度为0.5 mmol/L GSNO 的DMEM 完全培养基在细胞培养箱孵育12 h，每种浓度梯度设3 个复孔。MTT 比色方法同1.3.2。

1.3.4 荧光定量PCR 将EA.hy 926 细胞以105/mL 的密度接种于6 孔板中，分组为Control（Con）组、0.5 mmol/L GSNO 组、0.5 mmol/L GSNO+40 μmol/L THS 组，GSNO 组加入0.5 mmol/L GSNO损伤12 h，0.5 mmol/L GSNO+40 μmol/L THS 组先预给药40 μmol/L THS 1 h 后加入0.5 mmol/L GSNO 损伤EA.hy 926 细胞12 h。采用RNA 提取试剂盒（Thermo）提取各组EA.hy 926 细胞总RNA。紫外分光光度计测定OD 260/OD 280，计算各组总RNA 浓度，参照逆转录试剂盒说明书（Thermo）合成cDNA。采用Real-time PCR 检测目的基因相对表达量，扩增条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s/kb、72 ℃彻底延伸5 min，循环35 次。在退火步骤中采集荧光信号，每组基因重复3 组。引物序列合成见表1（Sangon Biotech）。

表1 线粒体相关因子引物序列Tab 1 Primer sequence of mitochondrial related factors

1.3.5 JC1 染色检测线粒体ΔΨm 将EA.hy 926 细胞以105/mL 的密度接种于6 孔板中，分组为Control组、GSNO 组、THS 组，GSNO 组加入0.5 mmol/L GSNO 损伤12 h，THS 组预给药40 μmol/L THS 1 h 后加入0.5 mmol/L GSNO 损伤EA.hy 926 细胞12 h。按照JC-1 试剂盒（碧云天）流程完成对各组Ea.hy 926 细胞的处理工作，将Ea.hy 926 细胞置于荧光显微镜下观察拍照，红色为正常线粒体膜电位，绿色代表线粒体膜电位下降。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 GSNO 对EA.hy926 细胞凋亡的影响

图1 所示，Bcl-2 蛋白随GSNO 损伤时间的增长逐渐下调，Bax 蛋白表达趋势与Bcl-2 蛋白表达相反，说明GSNO 能引起内皮细胞凋亡，且随时间增加不断加重。但其是否通过损伤线粒体进而引起细胞凋亡仍需进一步研究。

图1 GSNO 损伤不同时间对EA.hy 926 细胞凋亡蛋白表达的影响Fig 1 The effect of GSNO injury for different length of time on the expression of apoptosis protein in EA.hy 926 cells

2.2 THS 对内皮细胞的毒性研究

通过MTT 比色法检测各组细胞活性，80 μmol/L 与160 μmol/L THS 组细胞存活率分别为90.77% 和85.24%，与0 μmol/L THS 组相比略微下降，差异均无统计学意义（t=1.083，P=0.339 8；t=1.911，P=0.128 6）。5、10、20、40 μmol/L THS组细胞活性分别为102.04%、103.81%、106.03%和99.32%，与0 μmol/L THS 组相似，差异均无统计学意义，见图2。结果表明5～160 μmol/L 的THS 对细胞存活无影响，认为无细胞毒性。

图2 不同浓度THS 对EA.hy926 细胞存活率的影响Fig 2 The effect of different concentrations of THS on the survival rate of EA.hy 926 cells

2.3 THS 的最佳药物保护浓度

不同浓度THS 预给药1 h 后加入高浓度GSNO 损伤内皮细胞，图3 MTT 结果表明，5 μmol/L THS 对细胞内皮损伤的保护能力较弱（74.38%，t=2.716，P=0.053 2），10～160 μmol/L THS 均有明显的保护作用（87.2%，t=9.782，P=0.000 6；101.6%，t=43.36，P＜0.000 1；110.2%，t=13.6，P=0.000 2；88.8%，t=5.377，P=0.005 8；86.1%，t=12.95，P=0.000 2），其中40 μmol/L THS 对内皮细胞的保护能力最强（110.2%，t= 49.12，P＜0.01），且细胞毒性实验表明40 μmol/L THS（99.32%，t=13.6，P＜0.01）无细胞毒性，因此本实验选用40 μmol/LTHS 进行后续实验，研究其对GSNO 损伤内皮细胞线粒体的保护作用。

图3 THS 对GSNO 诱导的内皮细胞损伤后的保护作用Fig 3 The protective effect of THS on endothelial cell in⁃jury induced by GSNO

2.4 THS 对线粒体相关基因表达的影响

2.4.1ND-1与COX-1基因表达量 采用2-△△Ct法计算基因相对表达量，图4 结果显示：与Con 组比较，0.5 mmol/L GSNO 损伤内皮细胞后，ND-1的表达量显著增加（2-△△Ct=1.98，t=49.94，P＜0.01），但COX-1基因表达量明显减少（2-△△Ct=0.80，t=10.37，P＜0.05），说明GSNO 可能损伤内皮细胞线粒体基因。与0.5 mmol/L GSNO 组相比，THS 明显抑制了ND-1的表达（2-△△Ct=1.20，t=49.94，P＜0.01），并增加了COX-1的表达（2-△△Ct=0.94，t=5.461，P＜0.01）。

图4 THS 对GSNO 损伤EA.hy926 细胞12 h 后ND⁃1 和COX⁃1 基因表达的影响Fig 4 The effect of THS on the expression of ND-1 and COX-1 genes after GSNO injuried EA.hy926 cells for 12 hours

2.4.2IL-1β基因表达量 图5 所示，与Con 组相比，0.5 mmol/L GSNO 能显著上调IL-1β基因表达量（2-△△Ct=22.94，t=34.49，P＜0.01）。与0.5 mmol/L GSNO 组比较，GSNO+40 μmol/L THS 显著抑制IL-1β基因表达（2-△△Ct=1.26，t=33.86，P＜0.01），说明THS 有明显的抗炎作用。

图5 THS 对GSNO 损伤EA.hy926 细胞12 h 后IL⁃1β 基因表达的影响Fig 5 The effect of THS on IL-1β gene expression after GSNO injury in EA.hy926 cells for 12 hours

2.5 JC-1 线粒体膜电位变化

图6 所示，通过JC-1 试剂盒（碧云天）检测线粒体膜电位，正常的EA.hy926 细胞（Control 组）线粒体呈红色荧光；当线粒体膜电位下降后，红色荧光强度显著降低，而细胞浆中的绿色荧光显著增强（GSNO 组）。THS 干预后明显恢复内皮细胞红色荧光，降低了绿色荧光，说明THS 具有保护线粒体膜电位的作用。

图6 THS 对GSNO 损伤EA.hy 926 细胞线粒体膜电位变化的影响Fig 6 The change of mitochondrial membrane potential of EA.hy 926 cells 12 h after THS damages GSNO

3 讨论

ROS 和RNS 是细胞具有重要意义的代谢物［10］。相对低浓度下，它们在调节机体生理过程方面发挥多方面作用，但高浓度一氧化氮会产生高N2O3和ONOO-水平［11］。据报道，过量的N2O3和ONOO-可形成大量NO2和OH-自由基，并可能加剧蛋白质、脂类和DNA 的不可逆亚硝化和亚硝酰化［12］。有文献报道了ROS 和RNS 的过量产生是内皮功能障碍的特征之一［13］。同时也有研究显示，大量的RNS 可能引起细胞供能系统线粒体损伤和ROS 的大量释放［14］。

线粒体对于维持多种生理功能至关重要，mtROS 在细胞信号转导和维持机体内稳态中发挥关键作用。然而，过多的mtROS 产生会导致细胞氧化应激状态，这是线粒体功能障碍的标志之一，同时可能直接或间接通过氧化应激诱发血管功能破坏［15］。本实验通过高浓度GSNO（0.5 mmol/L）对内皮细胞系EA.hy 926 模拟高浓度RNS 损伤细胞模型，通过Western Blot 法检测GSNO 损伤不同时间凋亡相关蛋白的变化，发现GSNO 对凋亡蛋白Bax 的损伤呈时间依赖性增高，抗凋亡蛋白Bcl-2 则显示出与之相反的趋势，可以看出GSNO 作用于内皮细胞后，细胞随时间凋亡逐渐加剧。此外，MTT法验证了5～160 μmol/L THS 没有明显的细胞毒性，同时预给药THS 1 h 后给予高浓度GSNO 损伤内皮细胞，发现10～160 μmol/L 的THS 均对损伤后细胞有明显的保护作用，其中40 μmol/L THS 保护作用最明显，因此，本实验选用40 μmol/L THS保护内皮细胞验证其对内皮细胞线粒体损伤的保护作用。

线粒体是细胞ROS 的重要来源，实验和疾病模型的数据表明，过量的mtROS 在调节血管功能障碍中发挥着关键作用［16］。有人提出，COX-1的损伤导致ROS 中间体促进线粒体氧化应激活化凋亡信号通路［17-19］。线粒体ND-1基因是参与线粒体氧化磷酸化电子传递链的第一步，通过氧化磷酸化产生ATP［20］。本实验结果发现高浓度GSNO 损伤后COX-1表达量明显下降，同时ND-1出现明显增多，说明高浓度GSNO 可能通过损伤线粒体DNA 促进内皮细胞凋亡。和0.5 mmol/L GSNO 组比较，THS 能明显抑制ND-1和IL-1β基因表达，上调COX-1基因表达。Liu 等［2］研究发现线粒体膜电位的降低可能协同增加线粒体ROS 的释放，同时促进GSNO 次级反应性介质过氧亚硝酸盐的形成，进而加重线粒体的损伤。本研究采用JC-1 法发现GSNO 能明显降低线粒体膜电位，而THS 一定程度上恢复了线粒体膜电位，说明THS 对内皮细胞线粒体损伤具有一定的保护作用。

研究表明，线粒体功能障碍可能加重内皮功能障碍，导致炎症被激活［16］。同时也有研究表明，Bcl-2 和BAX 的激活不仅能导致COX 的释放，还导致了线粒体DNA（mtDNA）的释放，进而调节炎症反应［21］。因此笔者还检测了IL-1β基因的表达，发现其在高浓度GSNO 损伤下大量生成，说明内皮细胞线粒体存在炎症反应。

综上所述，GSNO 可能通过引起线粒体功能障碍，进而引发炎症因子大量释放并促进内皮细胞凋亡。同时，THS 在一定程度上保护内皮细胞免受高浓度GSNO 的损伤，保护血管内皮细胞线粒体损伤在防治心血管疾病中具有重要意义，其机制可能与上调线粒体关键基因COX-1，下调ND-1基因有关。但研究发现其对IL-1β的抑制效果更显著，可能还通过其他途径抑制炎症因子保护内皮细胞的损伤作用，因此需要更进一步研究其潜在保护机制。

作者贡献度说明：

黄巧凡，吴昊霖：参与实验，撰写论文；徐怡倩：参与实验，整理数据；樊好飞：指导实验，参与实验；方星悦：参与实验，购买耗材；王爱萍：参与实验，整理数据；虞道锐：参与实验，提供实验器材；孟庆雯：参与实验，整理数据；刘启兵：指导实验，参与实验，修改论文。