纤维素酶的基因研究进展及其应用

银 川，杨艳红 *，高焕方，江 蔚，严 欢

（1.重庆理工大学 化学化工学院，重庆 400054；2.陆军装备部驻重庆军事代表局，重庆 400060；3.重庆汇亚环保工程有限公司，重庆 400041）

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，还含有少量的果胶、树胶和黏胶等物质[1]，其中纤维素的含量占了35%～50%左右[2]。纤维素是一种相当稳定的大分子多糖，分子间存在许多氢键，因此整个纤维素分子结晶度和聚合度高，难以降解。

近年来，学者们已经从不同的生物体中鉴定并表征了许多纤维素酶高产菌株，但由于产酶活性低、处理效果不稳定以及菌种易退化等因素的限制，难以得到大规模的应用。随着基因技术和分子生物学逐渐发展，研究者们开始深入研究纤维素酶的基因层面，利用基因工程技术尝试对基因进行分离、克隆和异源表达来提高菌株产纤维素酶的能力，或者利用更精确的基因组工程技术直接在生物体内进行有针对性地基因破坏、敲除和添加，以获得产酶量高、活性高、易培养的工程菌。

目前对纤维素酶的基因/基因组工程技术研究报道的较少，王晓涛等[3]重点对纤维素酶的酶活测定、酶的生产以及应用方面的研究进展进行了探讨，但认为利用基因工程技术表达纤维素酶基因尚不成熟，还需要深入研究；何芳芳等[4]对纤维素酶的来源、结构和功能以及降解机制进行了详细的阐述，并对基因工程在纤维素酶的应用进行了展望；李旺等[5]综述了基因的克隆与表达，提出构建基因工程菌和高效表达系统是基因工程未来的发展趋势，但并未涉及基因组工程技术。

本综述的侧重点在纤维素酶的基因/基因组工程技术和纤维素酶工业应用的研究，其中纤维素酶工业应用部分已有综述文献，已有综述对食品业、饲料业和纺织业应用分析的较多，对于其它方面的应用分析的较少且综述的不够全面、深入，而本文的纤维素酶工业应用部分将对酿酒业、纸浆和造纸业、农业等领域进行深入分析。

1 纤维素酶及降解机理

如表1 所示，纤维素酶主要由细菌、真菌和放线菌产生[6]。作为一种复合酶，根据各组分酶作用方式不同，分为内切葡聚糖酶（E.C.3.2.1.4，C1酶）、外切葡聚糖酶（CBHⅠ，E.C.3.2.1.176；CBHⅡ，E.C.3.2.1.91，Cx 酶）以及β-葡萄糖苷酶（E.C.3.2.1.21，BGL 酶）。

表1 纤维素酶的主要来源

关于纤维素降解机理的研究有很多，Wood 等[7]在1972 年提出协同作用假说是目前广大学者最为认可的假说。该假说认为纤维素酶各组分之间相互协同，酶的水解效果与各组分的比例也有直接关系。协同作用主要有三种类型：1）C1-Cx 之间的协同作用：C1酶作用于纤维素分子的无定形区域，形成还原性和非还原性末端，为CBH Ⅰ型和CBH Ⅱ型后续作用提供底物；2）CBH Ⅰ-CBH Ⅱ之间的协同作用：CBH Ⅰ型和CBH Ⅱ型共同作用于由C1酶提供的还原和非还原末端的水解；3）Cx-BGL 之间的协同作用：BGL 作用于由Cx 催化释放的纤维二糖和低聚糖，产生葡萄糖。

2 基因工程和基因组工程的研究

2.1 基因工程和基因组工程的异同

目前，纤维素酶的基因研究主要包括基因工程和基因组工程的研究。这两者虽然都是对纤维素酶的基因进行研究，但从研究方法来看，它们存在明显的区别。如图1 所示[8]，基因工程是将目标基因分离出来，在体外进行修饰，然后利用遗传转化的方法再引入宿主生物体内，通过基因工程引入的基因在微生物中仍以质粒的形式或随机整合到宿主染色体中，也可以通过遗传转化的方法引入异源基因来改变生物体的生理结构；基因组工程是直接在生物体内对原生基因组进行基因修饰，包括在基因组DNA 的预定位点上，进行插入、替换和敲除等操作，精确的改变DNA 的排列顺序，以达到改变生物体的生理结构的过程。

图1 基因工程和基因组工程的区别[8]

2.2 基因工程技术在纤维素酶的基因研究中应用

随着基因工程技术的发展，编码基因的表达系统主要可以分为原核表达系统和真核表达系统，大肠杆菌作为原核表达系统的代表，也是使用最为广泛的原核表达系统，目前发现的编码纤维素酶的基因几乎都可以在大肠杆菌中进行异源表达。但是，由于原核系统细胞器较少，存在基因翻译后无法加工和修饰的问题，而且产生的纤维素酶大多数是胞内酶，增加提取纯化难度，因此真核表达系统开始逐渐用于表达外源基因来生产具有生物活性的真核生物蛋白，以毕赤酵母和酿酒酵母的真核表达系统使用最广泛。表2 总结了原核和真核表达系统的各自特点，以及纤维素酶基因在两种系统中成功表达的应用实例。

表2 基因工程不同表达系统区别

2.2 基因组工程技术在纤维素酶的基因研究中应用

由于生物系统的复杂性，对于一些复杂的性状可能需要多个基因同时调控，例如耐热性、耐酸碱性、稳定性等性状，改变单个基因很难实现预定的目标。为了克服这一限制，一种强大的多功能基因工具―基因组工程技术开始广泛应用。基因组工程技术主要包括两种方法：1）RNA 引导的内切酶介导（REM），2）工程化的内切酶介导（EEM）。TALENs 和ZFNs 等传统的基因编辑方法是基于EEM 的基因组工程方法，而CRISPR/Cas 系统是基于REM 的基因组工程的方法，与传统的基因编辑方法相比，CRISPR/Cas 系统具有组成简单、具有可逆性、应用范围广等优势，是目前使用最为广泛的基因编辑策略，也被应用于多种化学品的代谢工程改造和生产中。

蛋白质工程研究表明，通过对氨基酸特异性的修饰，可以改变纤维素酶的特异性，利用基因工程技术去改变单个基因的手段以获得优良的各种性状是极其困难的。基因组工程技术可以直接在纤维素降解菌的基因组中进行单个或多个位点修饰，从而改变纤维素酶的一个或多个氨基酸残基，这样可以增强其在生物体内的热稳定性，也可以增加纤维素酶的活性和酶对底物的耐受性[15]。表3 是利用基因组工程技术的不同基因编辑工具对不同微生物的基因组位点进行修饰和编辑，从而达到对纤维素酶的某个氨基酸或多个氨基酸位点进行突变来增强纤维素酶的耐热性、稳定性等特性的参考实例。

表3 氨基酸突变后的纤维素酶特性变化示例

3 纤维素酶的其他应用

随着越来越多的可用于工业生产的纤维素酶高产菌株被发现，除了在能源开发领域的应用外，在其他行业中的应用越来越广泛，例如食品、动物饲料、酿酒、纺织和洗衣、纸浆和造纸、农业等方面。如今，纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶占据了世界酶制剂市场的20%左右[28]，在未来市场份额还会越来越高。表4总结了纤维素酶在不同行业中的应用，对其中比较有前景的应用进行了详细描述。目前，国内外对纤维素酶在食品业、饲料业和纺织业应用分析的较多，本文将对纤维素酶在其他领域的应用研究进行更详细和全面的阐述。

表4 纤维素酶在不同行业中的应用

3.1 纤维素酶在啤酒和葡萄酒工业的作用

在啤酒酿造过程中，大麦要在淀粉酶、羧肽酶和纤维素酶的协同作用下产生高品质的麦芽。如果在发芽过程中出现未发芽或质量较差的大麦、麦汁过滤不严、流出时间慢、提取率低、产品中出现雾气等问题，会导致啤酒中形成凝胶或沉淀[39]。为了克服这个问题，在发酵过程中添加内切葡聚糖酶来降低麦芽汁的粘度，可以提高过滤的质量，进而提高啤酒品质和整体生产效率[40]。

在葡萄酒生产中，添加纤维素酶有助于植物细胞壁多糖的水解，从而大大改善葡萄的浸皮和提色，以及葡萄酒的品质[41]。BGL 还可以通过修饰糖基化前体来改善葡萄酒的香气[42]。

3.2 纤维素酶在纸浆和造纸工业中的作用

在生物机械制浆、去除纸张上的油墨涂层和碳粉、纤维的生物改性以及软纸制造等方面，纤维素酶的需求越来越高。机械制浆需要对木质原料进行精炼和研磨等，以便得到膨松度和硬度都很高的纸浆，但机械制浆的主要缺点是能耗高，生产效率低。在机械制浆过程中添加纤维素酶，可在精炼过程中节省大量能源（20%～40%），并提升纸张强度[43]。在纸浆纤维的生物改性中，纤维素酶可用于改善纸浆的可打浆性，从而实现高生产率和无故障的印刷过程。研究表明，纤维素酶能提高软木牛皮纸浆的可漂白性，处理效果可与用木聚糖酶处理过的纸浆相媲美[44]。另外，纤维素酶在处理回收的书本、杂志和报纸等废纸时最为有效，这些废纸可以通过脱墨和纤维再利用来重新制造成纸张或者生产燃料乙醇。单独使用纤维素酶或与木聚糖酶结合使用，对不同类型的废纸脱墨都是有益的。酶法脱墨的主要优点是避免了碱的使用，提高了纸浆纤维的色泽亮度、强度、自由度和清洁度，并减少了纸浆中的细小颗粒。在酸性条件下使用纤维素酶进行脱墨，还可以防止碱性黄化，简化了脱墨工艺，改变了油墨的粒径分布并减少了环境污染[45]。

3.3 纤维素酶在农业中的应用

为了促进农作物生长和控制植物病害，由纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的不同组合组成的各种酶制剂在农业中具有重要的应用价值。许多降解纤维素的真菌都能够促进种子发芽、植物快速生长以及作物产量的提高。从哈茨木霉CECT 2413中分离出的β-1,3-葡聚糖酶诱导了植物的形态变化，如菌丝尖端肿胀、细胞质渗漏以及许多隔膜的形成，并通过抑制致病性茄根霉和镰刀菌的生长来控制植物疾病[46]。来自哈茨木霉菌株P1 的β-1,3-葡聚糖酶和N-乙酰葡聚糖胺酶的协同作用抑制了灰质芽孢杆菌的孢子萌发和胚管伸长[47]。因此，使用纤维素酶可以作为生物防治剂来保护种子和植物免受病原体的侵害，还可以减少对肥料的依赖，从而改善土壤质量。

除上述应用之外，纤维素酶在生物燃料中的应用是将纤维素转化为葡萄糖和其他可发酵的糖类，而这些糖类又可以作为微生物的底物，用于生产单细胞蛋白或发酵产品（如乙醇）[42]。通过发酵将可再生资源纤维素转化为乙醇是生产替代燃料的重要工艺。在制药行业，由于人体对含纤维素的食品不易消化，因此人们可以使用一种消化酶产品，其中含有对细胞至关重要的纤维素酶和半纤维素酶，有助于食品中纤维素、半纤维素和β-葡聚糖聚合物的快速降解[48]。在废弃资源管理行业，森林农田和农用工业产生的废弃物中含有大量未利用或未充分利用的纤维素，造成资源浪费的同时也污染了环境。如今通过利用纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等，将这些所谓的废弃物合理地利用起来，生产出有价值的产品，如酶、糖、生物燃料、化学品、廉价的发酵能源、改良的动物饲料和人类营养品等[49]。

4 展望

尽管目前已经发现了大量的纤维素降解菌株，但由于产生的酶活性低、培养条件苛刻以及商业纤维素酶的成本限制了大规模的工业生产。在过去通过基因工程对菌株进行工程改造取得了一些成功，但是基因工程的过程复杂，并且基因的位置随时会发生变化，从而影响其表达水平。一种无需分离和改变基因位置即可显著改变基因的基因组工程方法将更为适用，并且不会干扰生物体的其他过程，直接在宿主微生物中提供了这种精确的基因改变。尽管与其他生物相比，这些方法可以轻松地应用于哺乳动物系统，但是哺乳动物系统并不能用于纤维素的降解中，纤维素降解主要集中在酵母、细菌和真菌上。尽快研究简便且具有成本效益的基因组测序方法将促进基因组工程的快速实施，改变微生物降解纤维素的性状特异性，从而改变生物质的特性。另外，对于纤维素酶的降解机理仍处于探究阶段，明确降解机理有助于优化纤维素酶的降解过程。总之，解析纤维素酶的降解机理和基因特性，形成一套系统的纤维素酶降解工程将会极大地推动生物质能源的发展。