高效液相色谱耦合柱前衍生化定量测定木质纤维素原料酸水解过程中还原糖的方法

杨世波，雀 静，宋云杉，范 敏，许 康，李冬雪，何 亮*

（1.昆明理工大学 化学工程学院，云南 昆明 650500；2.云南红塔蓝鹰纸业有限公司，云南 建水 654300）

由于不可再生化石资源的过度消耗和严重的环境污染问题，开发可再生的木质纤维素生物质资源以实现资源的可持续发展越来越受到人们的重视[1]。半纤维素作为木质纤维素的第二大组分，主要由木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖等组成[2]。在热水或酸水解过程中产生低聚糖和单糖，可用于高效转化为生物质材料、能源和化学品[3]。但是，现阶段对半纤维素水解低聚糖或单糖的检测方法尚不完善（如耗时长、操作复杂、检测范围局限、准确性差等）。因此，开发一种高效、准确、实用的还原糖组成分析方法对于评价水解效率和监测半纤维素溶出动力学行为至关重要。

目前，常用的糖含量测定方法有高效液相色谱法（HPLC）[4-5]、气相色谱法（GC）[6-7]、高效阴离子交换色谱法（HPAEC）[8]等，其中，带有示差折光率检测器（RID）的高效液相色谱因其操作简单、对单糖有直接反应而得到广泛应用。有研究报道利用该技术对四种不同木质纤维素生物质半纤维素组分制氢过程中的糖组分和降解产物进行了测定，实现了浓度为84.85～222.98 mmol/L 的葡萄糖、木糖等功能糖的测定[9]。此外还有研究以该技术测定了各种食品样品水解液中葡萄糖等功能糖的含量，其含量为4.30～32.33 g/L[10]。上述文献研究结果表明，示差折光率检测器能检测到的糖含量在3～35 g/L 之间，检测灵敏度低，无法准确检测浓度低于3 g/L 的低聚糖和单糖类物质，很不利于阐述各种单糖（尤其是含糖量较少的功能糖，如阿拉伯糖和半乳糖）在水解初期的溶出和降解行为。虽然功能糖可通过气相色谱衍生化进行测定，但该过程涉及许多蒸发、分离步骤，全过程耗时费力。还原糖是一种含有还原性端碳水化合物的特殊基团，尽管原始碳水化合物中缺乏发色基团，但经过化学衍生后，糖衍生物可以通过高效液相色谱与紫外检测器（UV）进行分析。1989 年Honda 等[11]用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）对糖类物质进行衍生化反应，得出该反应不需要脱水和异构化等操作，极大地节约了反应时间，同时还提高紫外检测器的检测灵敏度[12]。随后，PMP 衍生化反应被大量的学者进行研究[13-15]，这些研究主要是用于中药材或海藻类中单糖的分离与检测，而对木质纤维素生物质水解过程单糖测定的报道极少。最近克莱姆森大学的Wang 等[16-17]报道利用碳水化合物来建立衍生化反应的方法，并对比了不同的检测器对多糖分离检测的影响。但该方法的反应时间和液相检测时间较长，且未实际应用于木质纤维素原料的水解测糖。因此还需要对该方法进行优化，以用于木质纤维素水解过程中单糖检测的普遍性方法。

因此，本文在先前报道的研究基础上建立了一种较简单的柱前衍生法用于测定木质纤维素生物质水解液中还原糖含量的方法，即用PMP 与还原糖反应生成紫外光谱响应强的物质，然后用液相色谱―紫外检测器进行批量测定。本研究主要集中在PMP 柱前衍生化方法的建立、衍生化条件的优化以及流动相条件的优化，有效的缩短样品的反应时间和检测时间。对该方法的检出限、定量限、灵敏度、准确度等进行了讨论，并进行了方法比较。由于本方法所涉及的预处理过程仅包括衍生化和液-液萃取步骤，步骤简单、省时，可作为本领域人员检测水解液中糖含量的通用方法。

1 实验

1.1 材料与试剂

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，99%）、甲醇（HPLC 级，99.5%）、乙腈（HPLC 级，99.5%）购自上海麦克林生化有限公司。标准糖样品D-葡萄糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-纤维二糖、L-阿拉伯糖，D-木糖（99%）购自上海阿拉丁试剂有限公司。磷酸氢二钾、磷酸二氢钾购自天津化学试剂有限公司。

1.2 仪器与操作方法

使用UV/Vis 分光光度计（Agilent 8453 UV-Visible System,USA）通过全波长扫描确定衍生物的最佳吸收波长。高效液相色谱测量在Dionex UltiMate 3000 系统（Thermo Scientific,Waltham,MA,USA）上进行，采用UV-Vis 检测器（190～700 nm）和岛津C18 分析柱（Shimadzu,4.6 mm×250 mm,5 μm）对衍生物进行检测，并配备有自动进样器（0.1～100 μL）。紫外检测器波长为245 nm。洗脱以1.0 mL/min 的流速在45℃下进行。流动相A 为纯乙腈，流动相B 为0.05 M 磷酸缓冲溶液（pH＝6.8），流动相B 为在0-10-25 min内以84%-82%-81%线性下降的梯度洗脱。自动进样针进样体积为10 μL。

1.3 样品制备与测量步骤

PMP 衍生化方法基本如文献所述，并经过适当修改[11,18]，具体步骤如下。将200 μL 还原糖标准混合物样品溶液（2 mg/mL）与400 μL 0.3 mol/L 氢氧化钠混合加入到带有螺旋塞的小样品管中，随后加入400 μL 0.5 mol/L PMP 甲醇溶液。摇晃均匀后将整个混合物加热至70℃反应40 min，反应结束后立即冷却至室温并添加400 μL 0.3 mol/L 盐酸将混合物调至中性。所得混合溶液用氯仿（1 mL）萃取三次以除去残余的PMP，剧烈震荡，于2 763 g 相对离心力离心5 min。吸弃氯仿有机相，水相通过0.22 μm 的薄膜过滤器过滤，装入到1.5 mL 的顶空样品瓶中，立即用带有聚四氟乙烯/丁基隔膜的螺帽密封。最后将顶空样品瓶放置在自动进样器托盘中，用于自动HPLC 测量。

2 结果与讨论

2.1 波长的选择

经过衍生化反应后，还原糖的结构中含有可用紫外检测器检测的发色基团。由于糖衍生物在不同的波长下的吸光度不同，为确定最佳吸收波长对衍生物紫外吸收峰的影响，选择相同浓度（2 mg/mL）的单糖（葡萄糖）、二糖（纤维二糖）和六种还原糖标准品混合物进行衍生化反应。衍生化反应后，用紫外分光光度计对衍生物进行全波长扫描。吸光度与波长的关系如图1 所示。从图中可以看出，三种类型的还原糖衍生物在245 nm 波长处的吸光度均达到峰值。因此，后续采用HPLC 检测水解液各还原糖含量的紫外吸收波长选择为245 nm。

图1 不同还原糖标准溶液在不同波长下的吸光度

图2 不同衍生化反应时间下各还原糖衍生物的色谱峰峰面积

2.2 柱前衍生化过程参数的影响

2.2.1 衍生化时间

根据文献报道[13,16,19]，柱前衍生化反应时间大多为30～120 min，为了确定最佳衍生化时间，在相同的混合糖浓度（2 mg/mL），除时间外的其他参数不变的情况下，优化了反应时间对衍生化效率的影响。反应时间的影响如图2 所示。从图中可以看出，衍生物的色谱峰峰面积随着反应时间的增加而增加，反应时间大于40 min 后，色谱峰峰面积基本没有变化。结果表明，最佳衍生化反应时间为40 min，相比于之前文献报道，缩短了样品制作时间。

2.2.2 反应温度

随后，研究了不同温度对相同混合糖浓度（2 mg/mL）衍生化反应的影响。反应温度50、60、70、80和90℃对色谱峰峰面积（与衍生物的产率成比例）的影响结果如图3 所示。在50～70℃范围内，随着温度的升高，还原糖衍生物的产率增加，但在70～90℃的高温下进行反应会使色谱峰峰面积减小。结果表明，高温会破坏还原糖衍生物的结构。因此，建议在70℃下进行衍生化反应。

图3 不同反应温度下各还原糖衍生物的色谱峰峰面积

图4 不同PMP 用量下各还原糖衍生物的色谱峰峰面积

2.2.3 PMP 用量

一般来说，使用过量的衍生化试剂来保证反应的完全进行。因此，进行了一系列不同剂量PMP 与还原糖摩尔比的衍生化实验，结果如图4 所示。随着PMP 用量的增加，还原糖的色谱峰峰面积增大，当PMP用量为400 μL 时，色谱峰峰面积基本达到最大后趋于平缓。考虑到衍生化试剂的有效性，本研究选择400 μL PMP 进行后续衍生化反应。

2.2.4 流动相pH

由于pH 值影响含碱性基团的PMP-糖的电荷状态，pH 值对PMP-糖的保留和分离也有明显的影响。在乙腈比例相同的条件下，考察了磷酸盐缓冲液pH 值对保留时间的影响。结果表明，随着磷酸盐缓冲液pH值的增加，洗脱速度加快，衍生物的洗脱顺序不变。pH＝6.8 的磷酸盐缓冲液具有较好的分离效果和较快的洗脱效果。此外，在流动相中以甲醇为有机溶剂时，各还原糖衍生物的分离效果不如乙腈。因此，以0.05 M磷酸盐缓冲液（pH＝6.8）和乙腈为流动相进行梯度洗脱，给出了6 种中性糖PMP 衍生物的最佳分离条件。

2.3 方法验证

根据线性、灵敏度、精密度、重复性、稳定性和回收率对分析方法进行了验证。为了得到准确的单糖组成分析结果，将含有6 种还原糖的标准溶液稀释至不同浓度（0.01～1 mg/mL），验证了PMP 衍生化的检测线性。根据分析物标准品的色谱峰峰面积与浓度建立标准曲线，标准曲线的线性回归参数如表1 所示。所有还原糖的线性回归测定系数（R2）均大于0.999 0，表明紫外吸收与分析物浓度呈良好的线性关系。灵敏度由检测限（LOD）和定量限（LOQ）确定。LOD 是可检测到的最低分析物浓度，一般认为是信噪比为3∶1 的浓度。定量限被定义为以可接受的精度和准确度测定的最低浓度（信噪比为10∶1）。由表1 可知，6 种还原糖的检出限和定量限分别低于1.27 μg/mL 和4.22 μg/mL，检测灵敏度与之前报道的柱前衍生化方法有较大的提升。

表1 六种还原糖的标准曲线和检出限

通过测定每种标准还原糖衍生物的保留时间和色谱峰峰面积的相对标准偏差（RSD），确定方法的精密度、重复性和稳定性（表2）。通过连续6 次重复注射混合标准溶液（2 mg/mL）来评估精密度，保留时间的RSD 小于0.09%，色谱峰峰面积的RSD 小于2.14%。在相同浓度的6 种标准还原糖混合溶液中，采用优化的衍生化方法进行了PMP 的衍生化实验，并重复注射衍生物。在6 种标准还原糖的测定过程中，各还原糖保留时间的RSD 均小于0.19%，色谱峰峰面积的RSD 均小于1.67%。以上结果表明该衍生化方法具有较高的精密度和可重复性。另外，还测定了各还原糖衍生物在室温下24 小时内的稳定性，各衍生物保留时间的RSD 均小于0.18%，色谱峰峰面积的RSD 小于2.04%，表明PMP 衍生物在24 小时内具有较高的稳定性。

表2 六种还原糖精密度、重现性和稳定性的相对标准偏差

为了验证所开发方法的回收率，取不用浓度的玉米秸秆水解液，向其中加入高、中、低三种不同浓度的标准还原糖溶液，然后用优化的方法进行衍生化反应。衍生化反应后，用高效液相色谱法测定并计算样品中单糖的浓度，各样品的回收率见表3，回收率在95.89%～101.51%之间。结果表明，高效液相色谱法与PMP 衍生法相结合，六种还原糖都具有较高的回收率。

表3 三种加标水平下样品的回收率

优化后的柱前衍生化方法分别测定的标准还原糖混合液和玉米秸秆水解液，其色谱图如图5 所示，可见6 种标准还原糖（除木糖和阿拉伯糖外）分离度较高，达到基线分离，在25 分钟内实现单糖的分离，有效缩短了样品检测时间。木糖和阿拉伯糖均为五碳糖，其结构为手性对称的分子，两种还原糖的吸附力和分配系数极为相似。因此，在液相检测过程中从色谱柱流出的时间极为接近，在相同的保留时间出现同一个峰（本文以木糖/阿拉伯糖表示），这种现象在其他文献报道中也出现过类似的情况[15]。因此这一局限性需要更进一步研究，已达到更佳的分离程度。

图5 还原糖标准样品（A）和玉米秸秆水解液（B）中各还原糖PMP 衍生物的色谱图

2.4 方法对比

为了验证柱前衍生化测定单糖组分的实用性，随机选择10 个不同反应条件下的玉米秸秆水解液样品，采用常规高效液相色谱―示差折光检测器（RID）和柱前衍生化法测定水解液中的单糖。各水解液中单糖组分的结果见表4。结果表明，两种方法测定的10 个样品中葡萄糖和木糖含量差异不大，表明柱前衍生化法可用于精准地测定水解液中的葡萄糖和木糖。另外，示差检测器的检出限高于柱前衍生化方法，因此基本上只能检测水解液中浓度较高的葡萄糖和木糖，水解液中含量较低的部分纤维二糖和甘露糖未检测出。此外，柱前衍生化还可检测出水解中浓度较低的甘露糖和纤维二糖，表明柱前衍生化具有较高的检测灵敏度。

表4 柱前衍生化法与HPLC 示差折光检测法测定水解液样品中还原糖的比较

3 结论

建立了一种柱前衍生化测定木质纤维素水解液中还原糖含量的新方法。结果表明，该方法不仅具有良好的测量精度，可以准确地测定水解液中的各还原糖的含量。将该方法用于检测玉米秸秆水解液中的单糖含量，并与目前使用较普遍的高效液相色谱―示差检测法测定的结果相比，具有较高的准确度且还能检测出含量很低的单糖。与先前报道的柱前衍生化方法相比，该方法缩短了样品制备和检测时间，且提高了检测灵敏度。此外，该方法的精密度，准确性和可重复性的相对标准偏差分别小于2.17%、1.67%和2.04%，说明该方法具有很好的应用前景。此外，通过加标回收性实验，得到各标准糖的回收率为95.89%～101.51%。综上所述，本文所建立的水解液中还原糖组分测定方法简单实用，可普遍适用于木质纤维素水解液测糖等相关领域。