大盘鸡炒炖加工过程中蛋白质降解和微观结构变化

赵电波 栗俊广 柳红莉 白艳红

(1. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；2. 河南省冷链食品质量与安全控制重点实验室，河南 郑州 450001；3. 大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034)

鸡肉蛋白富含人体必需氨基酸，且种类齐全、比例均衡，具有较高的营养价值。肉与肉制品中的蛋白质不仅是主要营养物质的来源，也是形成产品品质(质构、风味和色泽)的物质基础。经加热处理后，肌肉蛋白质发生降解，产生一系列多肽、短肽、游离氨基酸、核苷酸、核苷等风味物质[1]。目前中国对于传统鸡肉制品的研究主要集中于加工方式的改进[2-3]、产品品质的改善[4-5]、贮藏与保鲜[6]、加工过程中有害物质的控制[7]、挥发性风味物质的成分分析及风味、滋味的呈现与保持[8]。有研究[9]表明，肌肉中蛋白质的降解、非蛋白氮(non-protein nitrogen，NPN)和游离氨基酸含量的变化对风味的形成具有重要作用。

大盘鸡是具代表性的中华传统炒制类鸡肉菜肴，以其独特的风味和良好的营养价值享誉海内外，深受消费者喜爱[5]。传统的大盘鸡制作方法是先炒制再炖炒，具有色泽鲜艳、爽滑麻辣、味道鲜美的特点。然而，以手工制作为主的大盘鸡，机械化程度低，没有形成标准化、工业化产品，市场流通量较小，产品附加值低。目前，智能烹饪已进入快速发展阶段，研究[5]表明，采用智能炒制方式制作的大盘鸡与传统手工制作在感官品质和质构方面无显著差异，但智能炒制方式能更好地保持大盘鸡的风味。研究拟采用智能炒制机模拟传统大盘鸡炒炖工艺，以制作大盘鸡的原料肉、炒制后的半成品和炖炒后的成品为研究对象，测定不同加工工序样品中游离氨基酸、不同氮含量并分析蛋白降解和微观结构的变化，以期为大盘鸡的工艺改进及工业化标准化生产提供指导或技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄羽肉鸡冷鲜鸡脯肉：屠宰后24～48 h，市售；

大豆油、精制盐、白砂糖、花椒、八角、干红椒、大葱、生姜：郑州市某大型超市；

化学试剂均为常用分析纯；

智能炒制机：郑州轻工业大学试制；

氨基酸自动分析仪：835-50型，日本日立公司；

半自动凯氏定氮仪：K9840型，中国海能公司；

高速分散器：XHF-D型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

高速冷冻离心机：TGL-20KR型，上海安亭科学仪器厂；

数显恒温水浴锅：HH.S4型，金坛市医疗器械厂；

真空冷冻干燥机：Lab-1-50型，北京博医康实验仪器有限公司；

扫描电子显微镜：JSM-7001F型，日本JEOL公司。

1.2 方法

1.2.1 原料肉的处理及样品制备 将黄羽肉鸡冷鲜鸡脯肉经净水清洗后，分割成长×宽×厚约为3.5 cm×3.5 cm×3.5 cm的鸡块，待用。结合前期感官评价结果，原料及调味料配比：原料肉100 g、大豆油6 g、白砂糖3 g、生姜1.5 g、花椒0.4 g、八角0.2 g、干辣椒1.2 g、盐1.4 g、水21 g、大葱段8 g。

智能炒制：智能炒制机预热后，依次按上述配比加入大豆油、白砂糖、鸡肉，炒制6 min；再加入生姜、花椒、八角、干辣椒、食盐、大葱段和水，炖炒10 min后，成品出锅。

1.2.2 样品采集 在原料肉、炒制后、炖炒后(成品)3个关键工序处取样，捞出鸡脯肉块，除去表面杂物，吸水纸吸掉表面汤汁，冷却至室温，待测。

1.2.3 氨基酸的测定 采用氨基酸分析仪[10]，试验重复3次，结果取平均值。

1.2.4 蛋白质水解指数(PI)的测定

(1)总氮(TN)含量测定：采用凯氏定氮法[11]。

(2)非蛋白氮(NPN)含量测定：参照邹良亮等[12]的方法并作适当修改，取3 g左右(精确到0.001 g)样品，加入25 mL 体积分数为10%的三氯乙酸溶液，冰水浴高速匀浆(10 000 r/min)，每次18 s，匀浆3次，4 ℃条件下静置12 h；于10 000 r/min条件下冷冻离心15 min，取上清液过滤并定容至25 mL，取2 mL进行消化用凯氏定氮法测定NPN含量。

(3)蛋白质水解指数(PI)计算：参照邹良亮等[12]的方法，按式(1)计算蛋白水解指数。

I=ωNPN/ωTN×100%，

(1)

式中：

I——蛋白水解指数，%；

ωNPN——非蛋白氮含量，g/100 g；

ωTN——总氮含量，g/100 g。

1.2.5 肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳分析

(1)肌原纤维蛋白提取：参考Zhao等[13]的方法，并稍作修改。鸡胸肉剔除可见结缔组织和多余脂肪，切成l～2 cm小块并绞碎；在0～4 ℃下将均匀绞碎的鸡胸肉(150～180 g)与分离缓冲液(10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，pH 7.0，4 ℃)按m鸡胸肉∶V缓冲液=1∶4 (g/mL)混合，高速分散器(10 000 r/min)中匀浆3次，每次30 s；所得肉浆用20目过滤网(孔径0.9 mm)过滤得滤液，4 127 r/min离心15 min，收集沉淀得到粗肌原纤维蛋白沉淀。将此肌原纤维蛋白沉淀分散在提取液(0.1 mol/L NaCl)中[m沉淀∶V提取液=1∶4 (g/mL)]，低速匀浆30 s(2 000 r/min)，4 127 r/min 离心15 min，重复相同步骤两次，得到纯化的肌原纤维蛋白放入碎冰屑中并置于4 ℃贮藏备用。

(2)电泳条件：参照Wang等[14]的方法，并稍作修改。将纯化的肌原纤维蛋白溶于浓度为0.6 mol/L的NaCl溶液中，采用双缩脲法测定并调整蛋白质浓度为10 mg/mL，分离胶为12.0%，浓缩胶为5.0%，浓缩胶电压为80 V，分离胶电压调整为110 V；电泳完成后，取出胶片在R-250染色液中染色30 min后，双蒸水冲洗，脱色液(甲醇—冰醋酸—双蒸水混合液，其中V甲醇∶V冰醋酸∶V双蒸水=100∶35∶365)中过夜脱色备用。

1.2.6 微观结构分析 参照Zhao等[13]和李可等[15]的方法，并稍作修改。将样品顺着肌原纤维方向切成长×宽×厚约为2 cm × 1 cm × 1 cm的肉块后，置于-85 ℃ 超低温冰箱中冷冻2 h后，再置于冷冻干燥机中干燥5 h，制成厚约0.1 cm的肉片并粘台，最后置于离子溅射装置中喷铂金，采用扫描电子显微镜观察其微观结构并拍照。

1.2.7 数据处理与分析 试验重复3次，采用Excel 2010进行数据统计，氨基酸含量取3次平均值；TN和NPN含量采用SPSS 17.0软件进行方差分析和差异显著性检验，当P<0.05时判定不同处理组之间存在显著差异。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸变化

由表1可知，鸡肉经炒制和炖炒加工后，所能检测到的氨基酸含量均呈上升趋势。炒制后的半成品和炖炒后的成品中的游离氨基酸含量分别为27.60，30.38 g/100 g，分别比原料肉增加了35.03%，48.63%。戚巍威等[16]研究认为，游离氨基酸的增加和减少取决于其形成量和降解量的比值，大盘鸡中游离氨基酸含量在炒制和炖炒阶段均高于原料肉。这可能是由于加热处理，使肌肉蛋白在氨肽酶的作用下发生降解生成游离氨基酸，导致其含量增加[17]4。

原料肉游离氨基酸中含量最高的是谷氨酸，为3.32 g/100 g，占所能检测到总氨基酸含量的16.24%，其次是赖氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、精氨酸和丙氨酸；大盘鸡炖炒后的成品中含量最高的也是谷氨酸，高达5.02 g/100 g，占所能检测到总氨基酸含量的16.52%，其次是天冬氨酸、赖氨酸、亮氨酸、精氨酸和丙氨酸。

谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸6种氨基酸是重要的呈味氨基酸[18]。试验原料肉中这6种呈味氨基酸含量为8.82 g/100 g，占所能检测到总氨基酸含量的43.15%；炒制后的半成品和炖炒后的成品中这6种呈味氨基酸含量分别为12.39，13.74 g/100 g，与原料肉相比，分别增加了40.48%，55.78%。这是由于加工烹饪过程中，鸡肉蛋白受热降解生成呈味游离氨基酸。

表1 大盘鸡加工过程中的氨基酸含量、滋味阈值及滋味特征†Table 1 The contents of amino acids,taste thresholds and characteristics of Dapanji during processing

炒制后的半成品和炖炒后的成品与原料肉相比，必需氨基酸含量分别增加了40.24%，53.78%；炖炒后的成品中必需氨基酸含量占所能检测到总氨基酸含量的45.23%，高于联合国粮农组织/世界卫生组织(FAO/WHO)推荐的成人理想氨基酸模式(36%)[18]。说明炒制和炖炒有利于大盘鸡营养价值的提升。炖炒后的成品中疏水性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)比原料肉和炒制后的半成品分别增加了56.17%，9.85%，表明疏水性氨基酸在炒制阶段被优先释放出来，含量增加较多。

作为滋味物质，游离氨基酸不仅具有甜、咸、酸、鲜等多种味道，还可与还原糖发生美拉德反应形成己醛、壬醛、庚醛等醛类物质，或通过Strecker降解形成一些脂类、醇类和酮类物质，而这些物质会进一步与脂类氧化产物进行反应，形成大盘鸡的特有滋味。由表1可知，大盘鸡成品中的各种游离氨基酸含量均高于其滋味阈值，尤其是鲜味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的含量分别是其阈值的167倍和98倍，这可能是提升大盘鸡风味的一个原因。

2.2 含氮物质及蛋白水解指数变化

TN含量、NPN含量及PI的变化可以客观地反映大盘鸡在加工过程中蛋白质的降解。由表2可知，原料肉经炒制后，TN含量有所增加，但不显著(P>0.05)，可能是由于炒制过程中的高温使鸡肉中的水分部分损失，导致TN含量相对增加；在炖炒阶段，水和食盐的加入促使部分盐溶性成分和水溶性含氮物质溶出到大盘鸡汤汁中，再者，炒制阶段产生的游离氨基酸、肽类等与脂肪水解所产生的各种脂肪酸发生反应产生了部分挥发性的含氮物质，造成炖炒后的成品中TN含量比原料肉显著降低(P<0.05)。

NPN是蛋白质发生降解的重要产物之一，主要包括除蛋白质以外的多肽、短肽、游离氨基酸、核苷酸、核苷等，也是表征蛋白降解的重要指标，其含量的变化会影响肉制品的品质。有研究[9]表明，蛋白质中降解程度最大的两种组织蛋白为肌浆蛋白和肌原纤维蛋白，这两种组织蛋白降解产生的NPN等成分对肉制品的品质有重要影响。由表2可知，炒制后的半成品NPN含量比原料肉有所增加(P>0.05)，主要是因为炒制时的高温使鸡肉蛋白发生降解，产生多肽、短肽、游离氨基酸、核苷酸、核苷等。炒制后的半成品继续加入食盐和水进行炖炒，而炖炒后的成品中NPN含量比原料肉和炒制后的半成品均显著降低(P<0.05)，可能是由于食盐抑制了肌肉蛋白质的降解，以及一些水溶性氨基酸和肽类分子转移到大盘鸡汤汁中。有研究[19-21]表明，食盐的添加会影响肌肉蛋白降解，且随着食盐添加量的增加，蛋白降解逐渐减弱，当食盐添加过多时，会完全抑制蛋白降解。这与试验结果一致。

表2大盘鸡炒炖加工过程中TN、NPN含量及PI的变化†
Table 2 Changes of total nitrogen,non-protein nitrogen contents and proteolysis index of Dapanji during the processing of stir-fried and stewed

样品TN含量/(10-2g·g-1)NPN含量/(10-2g·g-1)PI原料肉 3.522±0.185a0.203±0.007a5.8炒制后的半成品3.552±0.140a0.210±0.009a5.9炖炒后的成品 3.158±0.162b0.189±0.007b6.0

在大盘鸡整个加工过程中，PI呈上升趋势，说明在炒制和炖炒加工阶段，鸡肉蛋白发生了降解。PI的变化与游离氨基酸的变化相一致，表明炖炒后的成品中，游离氨基酸含量要高于炒制后的半成品。

2.3 肌原纤维蛋白SDS-PAGE电泳分析

由图1可以看出，原料肉中分子量>97 kDa的肌原纤维蛋白片段经炒制和炖炒后发生了部分降解；而由炒制后的半成品到炖炒后的成品，该蛋白降解不明显。原料肉中分子量为97 kDa的肌原纤维碎片和15～25 kDa的蛋白谱带(肌球蛋白轻链)颜色变淡、条带变窄甚至消失，表明大盘鸡炒炖加工过程中肌球蛋白发生了降解，其中炒制阶段发生了部分降解，炖炒阶段降解程度进一步加深，部分降解产生的小分子蛋白碎片未在电泳谱带呈现，可能是由于小分子蛋白碎片的分子量比较小，在电泳结束时已经跑出电泳谱带。鸡肉经炒炖加工后，分子量在29～37 kDa的蛋白谱带增多，可能是因为肌球蛋白受热变性，导致肌钙蛋白T脱落。有研究[22]认为，30 kDa左右的片段是肌钙蛋白T降解的特征产物。34，37 kDa肌联蛋白经炒制和炖炒后仍然存在于样品中且基本未发生降解，且在炒制和炖炒阶段无显著变化，由此可知，34，37 kDa肌联蛋白属于热稳定蛋白，与常亚楠[17]5，32的研究结论一致。原料肉中的G-肌动蛋白(43 kDa)，经炒制后电泳谱带颜色变淡、条带变窄，表明G-肌动蛋白经高温炒制后发生部分降解；炒制后的半成品继续炖炒至成品，G-肌动蛋白降解未发生显著变化，表明G-肌动蛋白具有较好的热稳定性，仅次于肌联蛋白。

由图1还可以看出，与原料肉电泳谱带相比，在炒制后的半成品和炖炒后的成品中，出现了47，55，60 kDa的肌原纤维蛋白谱带，可能是因为原料肉经高温炒制后肌球蛋白重链发生了降解。王振宇等[23]研究表明，当猪肉中心温度超过60 ℃时，190～200 kDa肌球蛋白重链开始降解并出现大量47 kDa和部分60 kDa的蛋白降解产物。Huang等[24]研究发现，猪肉肌原纤维蛋白中分子量约为220 kDa的肌球蛋白重链在温度升至100 ℃时降解显著并出现分子量约为47～60 kDa的蛋白降解产物。

2.4 微观结构变化

由图2可以看出，在大盘鸡炒炖加工过程中，鸡肉的肌纤维结构和肌膜发生了显著变化。与原料肉相比，炒制过程中原料由于受热而收缩，肌膜与肌纤维相分离，肌纤维间缝隙变大，导致肌纤维组织结构开始变得紧实，形状呈不规则多边形，大小不均一；在炖炒阶段，水的加入使鸡肉表面温度降低，随着炖炒时间的延长，鸡肉的中心温度逐渐升高，肌肉内部肌原纤维蛋白受热聚集、收缩[25]；张立彦等[26]研究表明，当中心温度达95 ℃时三黄鸡鸡肉中肌内膜和肌束膜发生崩解、胶原蛋白凝胶化而导致相邻肌纤维彼此排列变得紧实、致密。因此，炖炒后的大盘鸡成品肌膜溶解，肌纤维组织结构紧实，形状呈规则多边形，大小基本一致，肌纤维间紧密排列。

M.标准蛋白 A.原料肉 B.炒制后的半成品 C.炖炒后的成品图1 大盘鸡炒炖加工过程中肌原纤维蛋白SDS-PAGE图

图2 大盘鸡炒炖加工过程中扫描电镜微观结构图Figure 2 SEM of Dapanji during the processing of stir-fried and stewed

3 结论

采用智能炒制机炒制后的大盘鸡半成品中游离氨基酸、必需氨基酸和呈味氨基酸的含量比原料肉中的相应值分别增加了35.03%，40.24%，40.48%；经炖炒加工后的大盘鸡成品中游离氨基酸、必需氨基酸和呈味氨基酸的含量分别比原料肉中的相应值分别增加了48.63%，53.78%，55.78%；经过炖炒工艺可以增加蛋白降解程度。因此，大盘鸡制作过程中炖炒工艺有助于增加大盘鸡的营养价值和提升其滋味并改善产品口感。由于试验要测定氨基酸含量的变化，未添加老抽和味精等含有氨基酸的调味料。为了保持大盘鸡的原有滋味和风味，后续将进一步研究调味料对产品中氨基酸的贡献。