CRISPRi/ddCpf1 促进大肠杆菌中丙二酰辅酶A 的积累

洪煦琳， 贾 笑， 肖 毅

（上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240）

丙二酰辅酶A（malonyl-CoA） 是食品、保健品等产品中多种有价值化合物合成的重要前体物质，比如次级代谢产物类黄酮、聚酮化合物和脂肪酸等[1-2]。 大多数宿主中，丙二酰辅酶A 通过乙酰辅酶A 羧化酶 （acetyl-CoA carboxylase，ACC） 催化乙酰辅酶A 羧化合成而来[3]。 由于许多次级代谢产物的天然生产菌株难以大规模培养、 基因操作困难，易遗传操作的大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）已成为次级代谢产物生产的常用微生物细胞工厂。 然而，E. coli 中的丙二酰辅酶A 被用于产生脂肪酸和磷脂，仅留下少量可用于其他次级代谢[4-5]，是大规模生产目标次级代谢产物的潜在瓶颈[6]。 目前，通过基因调控提高丙二酰辅酶A 的含量，可以促进多种下游目标产物的生物合成，如白藜芦醇和柚皮苷等类黄酮化合物[7]。实验表明，丙二酰辅酶A 的常规基因敲除会明显影响细胞生长，导致生长迟缓甚至细胞死亡[8]。 而添加脂肪酸代谢抑制剂浅蓝菌素（cerulenin） 可以显著提高细胞内丙二酰辅酶A 的水平[9]，这表明可以通过调控基因转录来提高丙二酰辅酶A 水平。

基于成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR） 是一种适应性免疫系统， 常见于细菌和古细菌中，可以对外源侵入的核酸进行靶向切割，从而起到保护自身免受外源核酸侵害的免疫作用。 CRISPR 系统由Cas （CRISPR-associated protein） 蛋白和crRNA（CRISPR RNA） 相互作用形成核糖核蛋白复合体， 在成熟crRNA 的指导下，识别靶向DNA 序列并进行切割。 基因工程中，crRNA和tracrRNA 可以人工改造并融合成sgRNA（singlemolecule guide RNA） 用于基因组编辑[10]。 CRISPR干扰是一种基于CRISPR 系统的基因转录抑制技术， 利用催化失活的Cas 蛋白 （dead Cas protein，dCas）对特定基因转录进行下调[11]。以CRISPR/Cas9系统为例，dCas9 是Cas9 的催化失活突变体，dCas9-sgRNA 复合体能够与DNA 特异性结合而不进行核酸切割， 通过空间阻碍RNA 聚合酶（RNA polymerase，RNAP） 的转录过程，从而抑制目标基因的转录[11]。 代谢工程中，CRISPRi 技术可用于下调代谢竞争途径、抑制转运蛋白的活性等，从而提高目标产物的产量、减少毒性中间体和副产物[12]。目前，CRISPRi 已经被用于多种代谢工程宿主，包括Escherichia[13]、Mycobacterium[14]、Clostridium[15]、Corynebacterium[16]、Pseudomonas[17]。 Cpf1 是II 类Ⅴ-A 型CRISPR 系统， 具有和Cas9 同源的类RuvC 内切酶结构域[18]。 由于其具有组成简单、特异性高、能同时作用多靶点、脱靶效应更低[19]等优势，被视为常用基因编辑技术CRISPR-Cas9 的替代品，已经被开发成为多重基因编辑、基因调控的工具，应用于代谢工程[20-22]。 Ji 等用ddCpf1 替代化学抑制剂用于下调fabI 基因的表达，将丁烯酸的产量提高了6 倍[22]。Li 等在谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）中应用CRISPR/dCpf1 抑制gltA、pck、pgi 和hom 基因（参与赖氨酸合成） 表达，将赖氨酸产量提高了4倍以上[23]。

噬菌体T7 的基因2 编码的一种大肠杆菌RNA聚合酶抑制剂Gp2 蛋白， 可以干扰DNA 在RNAP下游的正确定位，有效抑制E-σ70转录起始[24]，表现了其在抑制基因转录中的调控潜力。 另外，小分子化合物可以通过生物分子传感器进行胞内实时检测和分析[25]。

作者首先构建了丙二酰辅酶A 的生物传感器，实现了丙二酰辅酶A 的快速、可视化检测。 随后在大肠杆菌中构建了CRISPRi/ddCpf1 系统，并尝试将ddCpf1 和Gp2 蛋白融合。最终通过CRISPRi/ddCpf1多靶点下调脂肪酸等代谢途径，实现了丙二酰辅酶A 的积累， 为解决其下游目标产物生物合成的瓶颈问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株与质粒大肠杆菌DH5α 用于载体构建，大肠杆菌BL21（DE3）用于生物传感器实验，由作者所在实验室保藏；Stable Competent E. coli 购于美国New England Biolabs 公司， 用于CRISPRi/ddCpf1 系统功能验证和优化；pS7a-acc、pBVSC 为作者所在实验室保存质粒，pAJK-RFP 质粒为作者构建。

1.1.2 实验试剂胰蛋白胨、 酵母提取物： 英国Oxoid 公司产品；GeneRular 1kb DNA Ladder、 琼脂糖凝胶回收试剂盒、Phusion Polymerase： 美国Thermo Fisher Scientific 公司产品；10× TAE buffer：大连美仑生物技术有限公司产品；卡那霉素、甘油、氯霉素：生工生物工程上海（股份）有限公司产品；L-阿拉伯糖： 上海麦克林生化科技有限公司产品；氯化钠、琼脂粉、葡萄糖：国药集团化学试剂有限公司产品；2×ES Taq Mastermix（Dye）：北京康为世纪生物科技有限公司产品；GeneRed 核酸染料、质粒小提试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司产品；10×DNA Loading buffer：南京诺唯赞生物科技有限公司产品；BSA（牛血清白蛋白）：德国Sigma 公司产品；T4 连接酶、Dpn I 、Bsa I 限制性核酸内切酶： 美国New England Biolabs 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制10 g/L 氯霉素（Cm）溶液：称取0.1 g Cm 粉末溶于10 mL 的无水乙醇中， 于－20 ℃避光保存备用。

100 g/L 氨苄青霉素（Amp）溶液：称取0.2 g 粉末溶于2 mL 的ddH2O 中，过滤除菌，于－20 ℃保存备用。

50 g/L 卡那霉素（Kan）溶液：称取0.1 g Kan 粉末溶于2 mL 的ddH2O 中，过滤除菌，于－20 ℃保存备用。

0.5 mol/L 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶液： 称取1.19 g IPTG 加入适量的灭菌ddH2O，定容至10 mL，过滤除菌，于－20 ℃避光保存。

LB 培养基：5 g 酵母提取物、10 g NaCl、10 g 胰蛋白胨， 加入去离子水搅拌混匀， 用量杯定容至1 L，高温高压灭菌20 min。 添加12 g/L 琼脂粉的LB培养基即为固体培养基。

1 mol/L 阿拉伯糖（Ara）溶液：称取0.75 g Ara粉末，加终体积为5 mL 的ddH2O 溶解，过滤除菌，4℃低温保存。

1.2.2 载体、引物和菌株构建载体采用Oligo anneal 和Golden-gate 克隆方法进行构建，构建模板来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、BglBrick 系列质粒[26]和Addgene 网站购买质粒。 引物合成于北京擎科生物科技有限公司上海分公司。 采用电转化法将构建好的载体转入大肠杆菌，挑取单克隆，获得目的菌株。

1.2.3 荧光值的测定将菌种置于3 mL 的LB 液体培养基（20 mg/L Kan 溶液、25 mg/L Cm 溶液、100 mg/L Amp 溶液， 抗生素添加种类根据具体菌株调整） 中220 r/min 条件下37 ℃振荡培养过夜。次日，将体积分数2%的种子液转接于3 mL 的LB 液体培养基（含相应的抗生素），振荡培养，在OD600为0.4～0.6 加入诱导剂，一定时间内吸取150 μL 或200 μL培养液于酶标仪中进行荧光值和OD600的测量。 对于ddCpf1 功能验证，OD600为0.6 时加入10 mmol/L Ara 溶液，2 h 后加入0.3 mmol/L IPTG， 振荡培养4.5 h，吸取200 μL 的培养液于酶标仪中进行测定。酶标仪设定程序： 发射波长612 nm， 激发波长560 nm。 相对荧光值的计算公式如下：

式中：F/OD600为相对荧光值；Fm为实验组荧光值；ODm为实验组OD600；Fb为LB 液体培养基的荧光值；ODb为LB 液体培养基的OD600。

2 结果与分析

2.1 丙二酰辅酶A 生物传感器的设计与构建

为了对大肠杆菌内的丙二酰辅酶A 进行方便检测，设计构建丙二酰辅酶A 生物传感器，通过红色荧光测量评估丙二酰辅酶A 的胞内浓度。 FapR蛋白来自枯草芽孢杆菌，可以特异性结合丙二酰辅酶A[25]。 如图1（a）所示，以J23119 启动子为改造基础，在-35、-10 区域前后插入FapR 蛋白结合位点，设计响应丙二酰辅酶A 浓度的启动子。 当胞内丙二酰辅酶A 浓度较低时，FapR 蛋白结合启动子，阻碍红色荧光蛋白 （red fluorescent protein，RFP） 表达；当胞内丙二酰辅酶A 浓度较高时，FapR 蛋白结合游离的丙二酰辅酶A，RFP 正常表达，可检测到显著红色荧光。 在此，设计了7 种不同FapR 蛋白结合位点的插入组合，见表1。 随后，构建丙二酰辅酶A 生物传感器（pAJK-RFP 质粒），用阿拉伯糖启动子控制FapR 蛋白组成型表达， 用丙二酰辅酶A 响应启动子控制RFP 表达，见图1（b）。

图1 丙二酰辅酶A 生物传感器原理图及质粒Fig. 1 Diagram and the plasmid of malonyl-CoA biosensor

表1 丙二酰辅酶A 响应启动子的序列Table 1 Sequences of malonyl-CoA responsive promoters

2.2 丙二酰辅酶A 生物传感器的评估

为了验证丙二酰辅酶A 生物传感器的功能，采用pS7a-acc 质粒过表达acc 基因促进丙二酰辅酶A 的积累，见图2。 将pAJK-RFP、pS7a-acc 质粒（见图1（b）和图2（b）） 转化E. coli BL21（DE3），分别采用0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L、100 μmol/L、1 mmol/L、10 mmol/L 的IPTG 诱导ACC 过表达，逐步使胞内的丙二酰辅酶A 浓度增加，从而开启生物传感器的荧光信号。 通过检测红色荧光值和OD600，计算生物传感器在不同IPTG 诱导浓度下的相对荧光值， 获得丙二酰辅酶A 生物传感器的响应曲线（见图3）。 J12 生物传感器渗漏控制较好， 在没有IPTG 的时候无显著荧光， 在100 μmol/L 以上的IPTG 存在时，可检测到显著的红色荧光，相对荧光值提高了3.26 倍；J233 生物传感器的荧光响应较为明显，在10 mmol/L IPTG 存在时，相对荧光值提高了5.83 倍。 后续实验选择J233 生物传感器进行。

图2 丙二酰辅酶A 生物传感器的功能验证Fig. 2 Functional verification of malonyl-CoA biosensor

图3 不同丙二酰辅酶A 生物传感器的响应曲线Fig. 3 Response curves of different malonyl-CoA biosensors

2.3 CRISPRi/ddCpf1 系统的构建

为了构建催化失活的Cpf1， 构建了来自Francisella novicida 的Cpf1 效应蛋白的3 个突变体， 分别是D917A 单突变、E1006A 单突变和D917A-E1006A 双突变。 为了验证CRISPRi/ddCpf1系统的功能及特点， 针对PTrc启动子诱导型表达的RFP 基因设计了4 个crRNA （见图4）：p-T、p-NT、R-T、R-NT，并分别靶向PTrc启动子的模板链、非模板链和靶向RFP 基因的模板链、非模板链。 以荧光数值来判断CRISPRi/ddCpf1 系统的效果。

图4 基于CRISPRi/ddCpf1 的基因抑制设计Fig. 4 Design of gene inhibition based on CRISPRi/ddCpf1

结果显示，当crRNA 靶向启动子区域时，p-T1、p-NT1 的相对荧光值在ddCpf1-M1 实验组中分别下降了89.7%和88.0%， 在ddCpf1-M2 实验组中分别下降了79.7%和87.8%， 在ddCpf1-M1-M2 实验组中分别下降了91.8%和87.0%（见图5）。 可见，突变效应蛋白ddCpf1-M1、ddCpf1-M2 和ddCpf1-M1-M2 对于p-T1、p-NT1 有较为明显的基因下调效果，且无论靶向模板链或非模板链均能得到较好的抑制效果，这与以前报道的研究结果一致[20]。当crRNA靶向RFP 基因，R-T1、R-NT1 的相对荧光值在ddCpf1-M1 实验组中分别下降了47.6%和2.2%，R-T1 的相对荧光值在ddCpf1-M1-M2 实验组中下降了57.4%（见图5）。 可见， 靶向RFP 基因时ddCpf1 的下调效率均小于靶向启动子区域时的下调效率。 对于CRISPRi/ddCpf1 系统，crRNA 靶向基因表达的启动子区域可以获得较好的基因下调效果。

图5 CRISPRi/ddCpf1 的基因抑制Fig. 5 Gene inhibition by CRISPRi/ddCpf1

2.4 CRISPRi/ddCpf1-Gp2 系统的构建

在应用中， 将dCas 蛋白融合其他功能蛋白是一个常见的改进策略。 有研究者利用dCas9 融合蛋白构建的CRISPRoff 蛋白可以持久且特异性地沉默基因表达[27]；也有研究者融合dCas9 和转录抑制子（如Kox1 的KRAB 结构域）， 在人类和酵母细胞中实现稳定有效的转录抑制， 揭示了dCas 融合蛋白在CRISPR 功能优化中的潜力[28]。 作者尝试将功能蛋白和ddCpf1 蛋白融合， 优化CRISPRi/ddCpf1 系统的调控功能。

研究发现，噬菌体基因2 编码的Gp2 蛋白可以降低RNA 聚合酶对启动子区域的DNA 亲和力，实现转录抑制[29]。受此启发，为了进一步提高转录抑制效率，将ddCpf1-M1 和Gp2 抑制蛋白进行融合表达（见图6（a））。 选择来自Enterobacteria phage BA14、Enterobacteria phage T3、Enterobacteria phage K1F和Klebsiella phage K11[30]的Gp2 蛋白，通过连接子（Ala-Ala，AA）， 分别在ddCpf1-M1 的N 端和C 端进行融合表达（CRISPRi/ddCpf1-Gp2），见图6（b）。

图6 CRISPRi/ddCpf1 关于Gp2 蛋白的基因转录抑制Fig.6 Transcriptional inhibition of CRISPRi/ddCpf1-Gp2

结果表明， 对于Enterobacteria phage BA14 的Gp2 蛋白，连接顺序为Gp2-AA-ddcpf1-M1 的实验组的相对荧光值下降了36.1%、OD600下降了47.4%，ddcpf1-M1-AA-Gp2 实验组的相对荧光值下降了 30.3% 、OD600下降了 57.3% ； 对于Enterobacteria phage T3 的Gp2 蛋白，ddcpf1-M1-AA-Gp2 实验组的相对荧光值下降了19.5%、OD600下降了63.5%； 对于Enterobacteria phage K1F 的Gp2 蛋白，Gp2-AA-ddcpf1-M1 实验组的相对荧光值下降了37.4%、OD600下降了44.9%，ddcpf1-M1-AA-Gp2 实验组的相对荧光值下降了24.2%、OD600下降了34.2%；对于Klebsiella phage K11 的Gp2 蛋白，Gp2-AA-ddcpf1-M1 实验组的相对荧光值下降了21.0%、OD600下降了51.9%，ddcpf1-M1-AA-Gp2实验组的相对荧光值下降了30.8%、OD600下降了65.1%（见图7）。 可见，4 种Gp2 蛋白均有一定抑制基因转录的功能， 但表达Gp2 蛋白的实验组中，OD600均显著降低。 这可能是因为Gp2 蛋白的表达产生了毒性，在一定程度上干扰了大肠杆菌的生长和代谢，导致CRISPRi 的低效。

图7 4 种Gp2 蛋白的基因抑制结果Fig. 7 Gene suppression of four Gp2 proteins

2.5 通过CRISPRi/ddCpf1 技术促进大肠杆菌中丙二酰辅酶A 的积累

CRISPR 干扰可以下调基因的转录， 从而调控基因表达。为了促进大肠杆菌中丙二酰辅酶A 的合成，利用ddCpf1 双突变体（D917A-E1006A） 构建了CRISPRi/ddCpf1 双靶点系统，设计了CRISPR array（ 见表2） 同时靶向两个基因：adhE （ 编码acetaldehyde dehydrogenase， 乙醛脱氢酶） 基因、fabF （编码3-oxoacyl-acyl carrier protein synthase II，3-氧代酰基-酰基载体蛋白合酶II） 基因和fabB（编码3-oxoacyl-acyl carrier protein synthase I，3-氧代酰基-酰基载体蛋白合酶I ）基因、sucC（编码succinyl-CoA synthetase，琥珀酰辅酶A 合成酶） 基因[1]，并进行CRISPR 干扰。通过检测RFP 相对荧光值，对胞内丙二酰辅酶A 进行测量，见图8（a）。 其中，CRISPRi/ddCpf1 系统由载体pBVSC 表达，丙二酰辅酶A 生物传感器由载体pAJK-J233 表达。

表2 CRISPRi/ddCpf1 基因转录抑制系统的CRISPR array 序列Table 2 Sequences of CRISPR array in CRISPRi/ddCpf1 gene transcriptional inhibition system

如图8（b）所示，相对于对照组（丙二酰辅酶A生物传感器菌株，不加诱导剂），CRISPRi/ddCpf1 系统靶向adhE/fabF 基因时相对荧光值增加了46.2%， 靶向fabB/sucC 基因时相对荧光值增加了149.5%。 可见，CRISPRi/ddCpf1 多重靶向策略显著促进了丙二酰辅酶A 的积累。

图8 CRISPRi/ddCpf1 促进丙二酰辅酶A 的积累Fig. 8 CRISPRi/ddCpf1 promotes the accumulation of malonyl-CoA

3 结 语

丙二酰辅酶A 是重要的前体物质，其合成被认为是大规模生产目标次级代谢产物的潜在瓶颈。 研究表明，其常规基因敲除会影响细胞生长。 因此，利用CRISPR 干扰技术实现基因转录下调， 从而促进丙二酰辅酶A 的积累。为了比较丙二酰辅酶A 的浓度，作者以J23119 启动子为改造基础，构建了7 个不同的丙二酰辅酶A 生物传感器，通过红色荧光值的测定实现了丙二酰辅酶A 的快速、 可视化测量。然后，构建了CRISPRi/ddCpf1 基因干扰系统，成功实现了目的基因的基因沉默，并比较了不同ddCpf1突变体、 不同crRNA 靶向位置对基因沉默的影响。随后， 尝试融合Gp2 和ddCpf1 效应蛋白对该CRISPRi/ddCpf1 系统进行优化，但基因转录下调效率没有显著提升。 最后，利用CRISPRi/ddCpf1 技术同时靶向两个基因（adhE、fabF 和fabB、sucC） 进行CRISPR 干扰，显著促进了丙二酰辅酶A 的积累，为其下游目的产物的高效合成提供了技术参考。 在后续研究中， 需要尝试融合其他蛋白、 设计CRISPR array 进行多重基因抑制等，实现对基因转录下调效率的控制。