“邵氏五针法”配合双侧“足三里”对慢性哮喘模型大鼠肺组织中SP、VIP蛋白表达影响的研究

胡晓京，邵素菊，华金双，王培育，张君，任重，徐宁，田丽

（河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450000）

支气管哮喘是一种常见的慢性呼吸系统异质性疾病，特征为由多种细胞及细胞组分参与的慢性炎症，同时伴有可变的气流受限和气道高反应性，随着病程的延长和病情的加重，可导致气道重构［1］。目前中国约有3 000 万人罹患哮喘［2］，14 岁以上的人群中哮喘患病率为1.24%，城区的总体控制率为28.5%［3］，给个人和社会造成了巨大的经济负担。如何防治哮喘已成为全球医学界所面临的重要课题［4］。针灸治疗哮喘具有操作简便、疗效显著的特点，“邵氏五针法”是邵经明教授在多年临床实践中不断探索总结出的一种安全有效的哮喘防治方法［5］。本实验以慢性哮喘模型大鼠为对象探究哮喘的神经源性炎症机制，从兴奋性神经和抑制性神经入手，通过观察慢性哮喘模型大鼠肺组织中的非肾上腺素能非胆碱能（NANC）兴奋性神经肽P 物质（SP）、NANC 抑制性神经肽血管活性肠肽（VIP）蛋白的表达，探讨“邵氏五针法”治疗哮喘的作用机制，为针灸治疗哮喘提供更科学的实验支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性SPF 级SD 大鼠40只，体质量180～200 g（河南省实验动物中心提供），实验动物许可证号：SYXK（豫）2017－0001。将大鼠置于温湿度适宜的环境中适应性喂养5 d，根据计算机统计软件产生的随机数字表将大鼠随机分为空白组、模型组、艾灸组和针刺组，每组10 只。大鼠分笼饲养，编号称重。本实验已通过动物伦理审查（伦理编号：DWLL201710327）。

1.2 主要试剂与仪器

卵蛋白（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180521）；氢氧化铝干粉（上海麦克林生化科技有限公司，批号：20180411）；4%多聚甲醛（大连美仑生物技术有限公司，批号：MA0192－Apr－14D）；SP 抗体（Bioss，批号：AG07171868）；VIP 抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号：ZP3878BP78）；一次性毫针（φ0.30 mm × 13 mm，北京中研太和医疗器械有限公司）；细艾条（φ0.7 cm×12 cm，临湘市湖香艾生物科技有限责任公司）；彩色图像分析系统（西安华海电子有限公司）。

1.3 模型制备

实验第1天和第8天时向模型组、针刺组和艾灸组大鼠腹腔内注射10%的复合OVA抗原液1 mL致敏，空白组大鼠注射1 mL生理盐水。实验第15天，将大鼠置于密闭的雾化箱内，模型组、针刺组、艾灸组用雾化器喷入1%的卵蛋白溶液20 min激发哮喘，空白组用雾化器喷入0.9%的生理盐水20 min激发哮喘，隔日1次，连续6 周。大鼠出现呼吸急促或节律不齐，抓耳挠腮，烦躁不安，轻度紫绀，甚则四肢瘫软，俯伏不动，连续激发后大鼠毛色失去光泽，反应迟钝即为造模成功。

1.4 治疗

针刺组：实验第15 天起，采用φ0.30 mm × 13 mm毫针直刺大鼠双侧“肺俞”、“大椎”、双侧“风门”、双侧“足三里”，针刺深度分别为6、5、6、7 mm。每10 min行针1 次，采用平补平泻手法，共留针20 min。起针后激发，隔日1次，连续6周。

艾灸组：实验第15 天起，采用细艾条在大鼠双侧“肺俞”、“大椎”、双侧“风门”、双侧“足三里”上方2～3 cm处施灸。“肺俞”“大椎”“风门”采用回旋灸，“足三里”采用温和灸，每次施灸10 min。灸后激发，隔日1次，连续6周。

空白组、模型组每次均给相同力度抓握刺激，不做任何治疗。隔日1次，连续6周。

1.5 指标检测

1.5.1 取材

末次治疗后24 h内，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，迅速消毒，打开胸腔，充分暴露肺和心脏，取右肺中下叶（包括肺门），立即放入装有新鲜配制的4%多聚甲醛溶液的玻璃瓶中，用滤纸与脱脂棉置于瓶口，使组织充分浸润于多聚甲醛中，做好标记，固定1周，石蜡包埋。

1.5.2 HE染色

将肺组织蜡块进行切片、烤片，依次经过二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ5 min→二甲苯Ⅲ10 min 脱蜡；无水乙醇Ⅰ3 min→无水乙醇Ⅱ3 min→95%乙醇Ⅰ3 min→95%乙醇Ⅱ3 min→90%乙醇3 min 水化；苏木素染色5 min→1%盐酸乙醇（2～3 s）→流水冲净肥皂水反蓝15 min→伊红染色8 min 进行染色；80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ1 min、95%乙醇Ⅱ分别1 min→无水乙醇Ⅰ3 min→无水乙醇Ⅱ3 min 脱水；二甲苯Ⅰ2 min→二甲苯Ⅱ2 min透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察各组肺组织情况。

1.5.3 肺组织免疫组织化学染色

将肺组织蜡块进行烤片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%H2O2氧化，抗原修复，5%BSA封闭液封闭，一抗（用PBS 按1∶200 比例稀释的SP、VIP 抗体）孵育，二抗（生物素标记山羊抗兔IgG）孵育，SABC（亲和素从链霉菌）孵育，DAB 显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察肺组织中SP、VIP 阳性信号，随机在每个切片中选取5 个高倍视野（× 400），测定每个视野中阳性表达的光密度值，取其平均值，记录数据。

1.6 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计分析软件进行处理。计量资料采用均数±标准差（±s）表示。首先进行方差齐性检验，若符合正态分布且方差齐，则进行单因素方差分析。若方差不齐，采用非参数检验进行分析，以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为体征情况

空白组大鼠无异常表现，呼吸均匀，毛色光洁，反应灵敏，饮食、二便均正常，雾化吸入0.9%生理盐水激发后无明显变化；模型组大鼠激发后，出现呛咳、呼吸急促、抓耳挠腮、烦躁等情况，多次激发后，大鼠精神不振，反应迟缓，呼吸喘促，皮毛蓬松无光泽，饮食量减少，粪便颗粒变小，质地干硬；针刺组、艾灸组大鼠致敏后皆出现模型组相同症状，如呼吸急促、抓耳挠腮、烦躁不安、呛咳等，经过针刺或艾灸治疗后，与模型组相比，大鼠呼吸较平稳、呛咳症状明显减轻，精神尚可，活动较灵敏，饮食、二便基本正常。

2.2 各组大鼠肺组织HE染色形态学观察比较

空白组大鼠肺组织结构完整，肺泡壁清晰完整，支气管管腔规则，平滑肌和血管壁未见明显增厚，少见炎性细胞浸润。模型组大鼠肺组织结构紊乱，肺泡壁不完整，气道黏膜上皮脱落，支气管管壁增厚狭窄，腔内见黏性分泌物及脱落的上皮细胞，气管周围及肺间质内大量炎性细胞浸润，平滑肌增厚。针刺组大鼠肺泡壁清晰，平滑肌及支气管壁轻度增厚，腔内极少量黏液及脱落的上皮细胞，血管及支气管附近少量炎性细胞浸润。艾灸组大鼠气道黏膜上皮组织基本完整，平滑肌及支气管壁增厚不明显，炎性细胞浸润较少。见图1。

图1 各组大鼠肺组织形态学比较（HE染色，×400）

2.3 各组大鼠肺组织中SP蛋白表达情况比较

与空白组相比，模型组大鼠肺组织内SP 蛋白阳性表达明显增多（P< 0.01）；与模型组相比，针刺组、艾灸组大鼠肺组织内蛋白阳性表达均明显减少（P <0.01）；针刺组和艾灸组相比，SP 蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1、图2。

图2 各组大鼠肺组织中SP蛋白表达比较（×400）

表1 各组大鼠肺组织中SP蛋白表达情况比较（±s）

表1 各组大鼠肺组织中SP蛋白表达情况比较（±s）

注：各组间比较，F = 138.442，P = 0.000 < 0.01；与空白组相比，△P<0.01；与模型组相比，▲P<0.01。

组别空白组模型组针刺组艾灸组n 10 10 10 10 SP平均光密度值0.106±0.030 0.388±0.041△0.201±0.032▲0.223±0.019▲

2.4 各组大鼠肺组织中VIP蛋白表达情况比较

与空白组相比，模型组大鼠肺组织内VIP蛋白阳性表达明显减少（P<0.01）；与模型组相比，针刺组、艾灸组大鼠肺组织内VIP 蛋白阳性表达均明显增多（P<0.01）；针刺组和艾灸组相比，VIP蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2、图3。

表2 各组大鼠肺组织中VIP蛋白表达情况比较（±s）

表2 各组大鼠肺组织中VIP蛋白表达情况比较（±s）

注：各组间比较，F = 85.950，P = 0.000 < 0.01；与空白组相比，△P<0.01；与模型组相比，▲P<0.01。

组别空白组模型组针刺组艾灸组n 10 10 10 10 VIP平均光密度值0.320±0.029 0.117±0.035△0.239±0.029▲0.228±0.020▲

图3 各组大鼠肺组织中VIP蛋白表达比较（×400）

3 讨论

哮喘是以发作性喉中哮鸣有声，呼吸困难，甚则喘息不得平卧为主要表现的顽固发作性肺系疾病。中医学认为哮喘的病因病机是脏腑虚弱，宿痰伏肺，复因外邪侵袭、饮食不节、情志过激等触发，导致气滞痰阻，气道挛急，发为哮喘［6－7］。哮喘为本虚标实之病，发作期以邪实为主，未发时以肺、脾、肾等脏腑虚弱之证候为主。哮喘的治疗遵循“发则治标，缓解治本，发作期与缓解期并重”的原则。本实验选取慢性哮喘模型大鼠，运用邵经明教授所创“邵氏五针法”，以“肺俞”“大椎”“风门”为主穴，同时选取“足三里”作为配穴［8－10］。肺俞属于足太阳膀胱经，内应肺脏，是肺之精气输注于背部的处所，具有调理肺气，止咳平喘，实腠固卫之功，可统治呼吸系统内伤外感诸疾，为治疗肺病之主穴。《针灸资生经》记载：“凡有喘与哮者，为按肺俞，无不酸痛”。大椎穴为“诸阳之会”，是督脉与手足三阳经交会之处。《针灸甲乙经》言大椎为“三阳督脉之会”，治疗哮喘可祛风散寒、宣肺平喘、理气降逆。风门属足太阳膀胱经穴，在肺俞上方，亦内应肺脏，为风邪入侵机体之门户，针之有疏散风邪、调理肺气之功［11－13］。哮喘多为慢性疾病，往往迁延难愈，患者病久体虚，配合足三里可以健脾和胃、扶正祛邪，与主穴合用，可健脾化痰、培土生金。

哮喘发病机制复杂，气道的慢性炎症贯穿于哮喘的整个过程，其中非肾上腺素能非胆碱能（NANC）神经介导的神经源性炎症机制受到越来越多的关注，该神经无法被胆碱和肾上腺素拮抗剂阻断［14］。P 物质（SP）是NANC兴奋神经系统释放的收缩支气管平滑肌的感觉神经肽［15］，多见于支气管壁和肺泡壁，可引起支气管平滑肌收缩、黏液分泌增多等［16］。SP 具有强大的致炎作用，可激活巨噬细胞、中性粒细胞等炎症细胞，释放IL－1、IL－6 和TNF－α 等细胞因子。血管活性肠肽（VIP）是NANC 抑制神经系统释放的舒张支气管平滑肌的神经介质，含VIP 免疫反应的神经纤维分布于人体的气道平滑肌、气道上皮及黏膜下腺周围，具有较强的舒张支气管、抑制炎症和抗损伤作用［17－18］。SZEMA 等［19］发现VIP 在调节气道收缩和哮喘炎症反应中起着重要的生理作用，肺组织中VIP 的缺乏可导致哮喘的发生。

本次实验结果显示，与空白组相比，模型组大鼠肺组织中神经肽SP表达明显增加，VIP表达明显减少，使气道收缩痉挛，肺组织炎性浸润加重，从而发生哮喘；与模型组相比，针刺组、艾灸组肺组织中SP 表达均明显减少，VIP 表达均明显增加，可见针刺、艾灸“肺俞”“大椎”“风门”均可下调肺组织中SP 的表达、上调VIP的表达，使支气管舒张，缓解气道平滑肌痉挛，改善肺组织炎症情况，从而缓解哮喘。故调节SP、VIP的失衡可能是针灸治疗哮喘的途径之一。