外用复方五凤草液对结核性溃疡患者MDM2、p53的影响

陈晓钰，黄子慧，钱佳燕，孙佳玥，陈思琪，曹丽敏

（南京中医药大学附属南京市中西医结合医院，江苏 南京 210021）

结核性溃疡是指结核分枝杆菌（MTB）经各种传播路径侵犯机体局部组织，引起病灶周围软组织、皮下及皮肤的坏死，最终液化破溃所形成的创面［1-2］，是临床最为常见的一种特异性感染性创面。春季为本病的高发季节，多见于年轻女性，临床表现为创面化脓流水，易形成窦道，创面不易愈合或假性愈合后反复发作、破溃流脓［3］。该病治疗颇为棘手，目前临床多采用抗结核药配合局部外用换药的治疗方案。复方五凤草液是临床应用较为成熟的外用中药［4］，由南京市中西医结合医院瘰疬科黄子慧主任总结科室名老中医治疗本病几十年经验所得，具有泄毒生新之功，临床使用多年，疗效显著。本课题组前期已开展复方五凤草液的相关机制研究，通过观察M1、M2 型巨噬细胞的表型指标iNOS、Arg－1，发现复方五凤草液能促进Arg－1 表达、抑制iNOS 的过度表达［5-6］。为进一步从巨噬细胞极化平衡角度探析复方五凤草液的促愈合机制，课题组开展了对结核性溃疡患者血清、组织中巨噬细胞调控因子MDM2、p53 的研究，研究结果如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

研究对象为2020年1月1日—2020年12月31日期间经南京中医药大学附属南京市中西医结合医院通过病理学证实为结核性溃疡患者76 例，随机分为实验组和对照组。其中实验组中男性16 例，女性22 例，年龄20～75 岁；对照组中男性18 例，女性20 例，年龄19～73 岁。两组患者性别分布及年龄分布经统计学处理，差异均无统计学意义，具有可比性。

1.2 给药

实验组：基础抗结核化学治疗+ 复方五凤草液（组成：五凤草2 000 g，白及240 g，猫爪草400 g，由南京市中西医结合医院中药制剂室提供），外用。

对照组：基础抗结核化学治疗+康复新液（四川好医生攀西药业有限责任公司，国药准字Z51021834），外用。

基础抗结核化学治疗方案：3HREZ/9～15HRE 或3HRSZ/9～15HRE。

外用药物使用方法：根据创面大小剪取适当面积无菌棉片，以复方五凤草液或康复新液浸湿（注意以轻挤不滴水为宜）外敷，大致为0.5 mL/cm2，若有窦道则将棉片深入窦道内，2 d换药1次。共治疗28 d。

1.3 主要试剂及仪器

MDM2 ELISA检测试剂盒（JL45544）；人p53 ELISA 检测试剂盒（JL12676）；TRIzolTM LS Reagent（Thermo Fisher Scientific，10296010）；PrimeScript™PT Master Mix（Perfect Real Time）试剂盒（Takara，RR036A）；ChamQ ™SYBR®qPCR Master Mix（Without ROX）试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司，Q321－02）；RIPA（放射免疫沉淀法）蛋白裂解液（Beyotime，Henan，China，P0013C）；BCA 试剂盒（碧云天生物技术有限公司，中国，P0010S）；MDM2 兔抗人单克隆抗体（Affinity Biosciences，OH，USA，AF0208）；p53兔抗人单克隆抗体（Affinity Biosciences，OH，USA，AF0879）；二抗（Affinity Biosciences，OH，USA，S0001）。

酶标仪（美国BioTek 仪器有限公司，Victor3 plate reader）；实时荧光定量PCR仪（罗氏，LightCycler 480）；37 ℃恒温培养箱（上海一恒，DHG－9031）；台式高速冷冻离心机（Sigma，1－21K）。

1.4 方法

1.4.1 治疗前及治疗后第3、7、14、28 天的创面愈合率

通过扫描仪将创面情况录入微型计算机，采用Osiris 4.19 软件计算像素的方法进行创面面积计算。溃疡原始创面面积为第一次测量的创面面积，时相点未愈合面积为各时相点取材时测量的面积［4］。

创面愈合率（%）=（原始创面面积－时相点未愈合面积）/原始创面面积×100%

1.4.2 创面腐去时间及上皮生长时间

创面腐去时间：从创面初始用药到创面腐肉尽脱所需时间；上皮生长时间：从创面用药起到新肉长出所需时间。如患者在治疗结束后第28 天时仍有未完全脱尽的腐肉，则该患者的创面腐去时间按28 d计算。

1.4.3 ELISA 法检测两组患者血浆中MDM2、p53 蛋白表达情况

于受试者治疗前及治疗后第3、7、14、28 天分别取1 mL 的全血置于EDTA 抗凝管里，离心取得上层血浆样本，根据ELISA试剂盒说明书中的要求进行实验，根据标准曲线计算出各检测标本中相应指标的含量。

1.4.4 RT－qPCR 法检测两组患者血浆中MDM2、p53 mRNA表达情况

于受试者治疗前及治疗后第3、7、14、28 天分别取1 mL的全血置于EDTA抗凝管里离心取上层血浆。提取并测定血浆RNA 浓度，根据试剂盒说明书加入所需试剂，逆转录合成cDNA。使用ChamQTMSYBR®qPCR Master Mix（Without ROX）试剂盒进行RT－PCR 反应，测定MDM2、p53 mRNA表达水平。

所有引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列见表1。

表1 Real－time PCR检测引物列表

1.4.5 Western Blot 法检测两组患者创面组织中MDM2、p53蛋白表达情况

于受试者治疗前与治疗后第28 天换药时收集创面组织，从组织中提取总蛋白。BCA 法测定蛋白浓度后使蛋白变性；计算蛋白上样量，SDS－PAGE 胶电泳后转膜；封闭（脱色摇床，1 h）、敷一抗（4 ℃冰箱，脱色摇床，过夜）；洗去一抗，室温条件下敷二抗（脱色摇床，1.5 h），再次洗膜，用化学发光法暴露膜上的蛋白带。

1.5 统计学方法

使用SPSS 23.0 软件进行统计分析，计量数据采用均数± 标准差（xˉ±s）表示，以P< 0.05 代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者创面愈合率情况比较

随着治疗时间的增加，两组创面均逐渐愈合，第14 天起愈合趋势明显。与治疗后第7 天比较，两组患者治疗后第14、28 天的创面愈合率明显升高（P<0.05）；与对照组比较，在治疗后第28 天时，实验组的创面愈合率明显升高（P<0.05）。见表2。

表2 两组患者创面愈合率变化比较（±s，%）

表2 两组患者创面愈合率变化比较（±s，%）

注：与本组治疗后第7天比较，*P<0.05；与对照组同一时间比较，#P<0.05。

组别实验组对照组例数38 38第3天15.50±8.23 13.37±7.45第7天26.76±6.87 21.35±8.26第14天47.70±11.01*36.77±13.65*第28天90.17±7.38*#61.05±18.71*

2.2 两组患者创面腐去时间及上皮生长时间

与对照组比较，实验组的创面腐去时间及上皮生长时间均明显缩短（P<0.05）。见表3。

表3 两组患者创面腐去时间、上皮生长时间比较（±s，d）

注：与对照组比较，*P<0.05。

组别实验组对照组例数38 38腐去时间19.67±3.07*25.34±5.38上皮生长时间12.34±4.23*17.76±6.28

2.3 ELISA 法检测两组患者治疗前后血浆中MDM2、p53蛋白表达情况

组内不同时间点比较，与治疗前相比，第7、14、28 天时，实验组与对照组血浆中MDM2 蛋白表达水平均升高（P< 0.05），p53 蛋白表达水平均降低（P<0.05）。组间同一时间点比较，治疗前与治疗后第3 天时，实验组与对照组血浆中MDM2、p53 蛋白表达情况差异无统计学意义（P> 0.05）；第7、14、28 天时，与对照组相比，实验组血浆中MDM2 蛋白表达水平明显升高，p53 蛋白表达水平明显降低（P< 0.05）。见表4。

表4 两组患者血浆中MDM2、p53蛋白含量比较（±s，pg/mL）

表4 两组患者血浆中MDM2、p53蛋白含量比较（±s，pg/mL）

注：与同组治疗前比较，#P<0.05；与对照组同一时间点比较，*P<0.05。

组别实验组对照组例数38 38时间治疗前第3天第7天第14天第28天治疗前第3天第7天第14天第28天MDM2 3.87±0.95 4.32±0.77 6.06±1.75#*8.24±1.50#*10.76±1.78#*3.73±0.79 4.02±0.89 5.05±1.11#6.38±1.16#7.58±1.17#p53 482.52±100.36 408.78±93.90 298.16±68.55#*206.38±22.88#*106.18±15.64#*461.53±104.56 440.54±78.89 389.07±89.44#296.03±59.41#184.46±54.08#

2.4 RT－qPCR 法检测两组患者治疗前后血浆中MDM2、p53 mRNA表达情况比较

组内不同时间点比较，与治疗前相比，第7、14、28 天时，实验组与对照组血浆中MDM2 mRNA 表达水平均升高（P< 0.05），p53 mRNA 表达水平均降低（P< 0.05）。治疗前与治疗后第3 天时，实验组与对照组血浆中MDM2、p53 mRNA 表达情况差异无统计学意义（P> 0.05）；第7、14、28 天时，与对照组相比，实验组血浆中MDM2 mRNA 表达水平明显升高，p53 mRNA 表达水平明显降低（P< 0.05）。见表5。

表5 两组患者血浆中MDM2、p53 mRNA含量比较（±s，pg/mL）

表5 两组患者血浆中MDM2、p53 mRNA含量比较（±s，pg/mL）

注：与同组治疗前比较，#P<0.05；与对照组同一时间点比较，*P<0.05。

组别实验组对照组例数38 38时间治疗前第3天第7天第14天第28天治疗前第3天第7天第14天第28天MDM2 0.21±0.06 0.30±0.03 1.00±0.21#*1.35±0.24#*1.80±0.21#*0.22±0.04 0.26±0.04 0.44±0.06#0.65±0.08#1.12±0.05#p53 2.09±0.28 1.92±0.26 1.19±0.29#*0.60±0.11#*0.13±0.03#*2.16±0.25 2.00±0.30 1.63±0.28#0.85±0.22#0.38±0.08#

2.5 两组患者治疗前后创面组织中MDM2、p53 蛋白表达情况比较

与治疗前相比，两组患者治疗后创面组织中MDM2 蛋白表达水平均升高，p53 蛋白表达水平均降低；与对照组相比，实验组创面组织中MDM2、p53蛋白表达改善更明显。见图1。

图1 两组患者创面组织中MDM2、p53蛋白表达情况

3 讨论

结核性溃疡属于临床常见的肺外结核，在2018年世界卫生组织确认的630 万新发结核病例中，肺外结核约占16%［7］，而结核性溃疡占全部肺外结核的30%～40%［8-9］，其构成比远高于糖尿病足及压疮的发生率［10］。作为一种临床最为常见的特异性感染性创面，其治疗历来属外科难题。在慢性创面的修复中，中医药治疗具有明显优势。中医学认为，在该病发生、发展的过程中，痨瘥毒邪入侵和机体正气亏虚二者共同作用，互为因果。痨瘥毒邪炽盛，滞于肌表，导致气滞血瘀，日久肉腐成脓，进而溃破；脾胃虚弱，气血亏虚，无力托毒外出，创面破溃难敛；创面日久不敛则致虚损进一步加重，导致恶性循环，令本病迁延难愈［6］。

复方五凤草液为名老中医验方，在多年的临床实践中取得稳定疗效。方中重用五凤草行水杀虫，祛腐泄毒；白及敛疮消肿，生肌止血；猫爪草拔脓解毒，活血生新，共奏泄毒祛腐，生新活血之功效。课题组既往研究结果表明该药物的作用机制可能与调控巨噬细胞极化失衡有关［5］。

目前已知在参与慢性创面修复的众多细胞中，巨噬细胞起到了总指挥的作用［11］。不同的微环境下巨噬细胞可极化为M1和M2两种不同类型［12］，M1型主要参与炎症产生的起始和维持过程，通常出现在创面愈合的早期；M2 型在组织修复［13］、促进创面细胞增殖和血管化的形成中起到重要作用，M1 向M2 型转换是创面由炎症反应转为修复性反应的关键［14］。有研究表明，在TU 创面组织液化高峰期，创面组织中M1 型巨噬细胞显著高于M2 型，即M1 型募集、M2 型损耗的混合极化状态［15］。

在调节巨噬细胞极化的诸多通路中，PI3K/AKt 信号转导通路是许多重要细胞功能信号传递的中心，包括细胞黏附、迁移和血管生成［16-18］，其中调控因子MDM2、p53 与创面愈合联系密切。THOMASOVA 等［19］发现，MDM2 阻断抑制了缺血后促炎细胞因子和趋化因子的诱导，阻碍了白细胞向损伤部位的募集。ANKE 等［20］的研究结果表明，p53 能够激活亲氧化剂，促进自噬和抗氧化反应［21］，调节细胞修复、衰老、DNA损伤识别、增殖和迁移［22］，进而刺激皮肤中的核相关因子2（Nrf2）途径，导致谷胱甘肽含量增加，从而提高皮肤愈合的质量［23-24］。

本次研究通过设立药物对照组，动态观察结核性溃疡患者血浆、组织中巨噬细胞PI3K/AKt 信号转导通路中两个重要调控因子MDM2、p53 的表达水平，进一步探析复方五凤草液的作用机制。结果显示，随着治疗进展，两组创面都呈现逐渐愈合的趋势，实验组愈合率明显高于对照组，腐去时间与上皮生长时间均明显短于对照组。在治疗初期，两组患者血浆中MDM2、p53蛋白及mRNA 表达水平无明显差异；自治疗第7天起，随着创面愈合率的增加，MDM2蛋白及mRNA 表达逐渐升高、p53 蛋白及mRNA 表达逐渐降低，较之前相比均有统计学意义（P<0.05）；组间同时间比较，与对照组相比，第7、14、28天时实验组MDM2蛋白及mRNA 表达水平明显升高（P< 0.05），p53 蛋白及mRNA 表达水平明显降低（P< 0.05）。通过Western Blot 法验证两组患者溃疡组织中MDM2、p53 蛋白表达水平，结果治疗前两组患者创面组织中MDM2、p53 蛋白表达水平差异无统计学意义，治疗后均可见MDM2蛋白水平升高、p53 蛋白水平降低，且实验组的改善情况优于对照组，得出血浆与组织中MDM2、p53 同步变化这一结论。

本研究通过在体实验观察了复方五凤草液对结核性溃疡患者MDM2、p53 表达情况的影响，结果复方五凤草液显著促进了结核性溃疡的愈合，随治疗时间的增加，创面腐肉日渐脱落，血浆与创面组织中p53 表达逐渐降低；上皮逐步生长，MDM2表达逐渐提高。由此我们推测结核性溃疡创面愈合缓慢可能与MDM2－p53 表达失衡、巨噬细胞M1/M2 极化失衡有关，而复方五凤草液促进结核性溃疡创面愈合可能是通过上调MDM2 表达、下调p53 表达，进而平衡M1/M2 来实现的。此次实验尚有不足之处，并未有数据直接证明MDM2、p53 之间具体的调控关系，此后课题组将继续开展细胞及动物实验，多角度深入阐明结核性溃疡的发病机制以及复方五凤草液促进创面愈合的可能作用机制。