基于网络药理学和分子对接技术探讨黄精－枸杞药对治疗糖尿病合并认知功能障碍的作用机制

邱玲艳，王旭*

（1. 南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029；2. 南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029）

糖尿病合并认知功能障碍（diabetic cognitive impairment，DCI）是糖尿病常见的并发症之一，超过40%的糖尿病患者会出现认知功能障碍的症状［1］。近期研究表明［2］，糖尿病患者出现认知功能障碍的风险是正常人的1.2~1.5倍，严重者可导致阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD），极大地影响了糖尿病患者的生存质量。流行病学研究表明［3］，未来糖尿病合并认知功能障碍将会是人们面临的主要临床问题之一，已引起了人们广泛的关注。

中药具有多成分、多靶点、多通路的特点，在对于糖尿病合并认知功能障碍的患者治疗中具有明显的优势［4］。中医学认为糖尿病合并认知功能障碍的基本病机在于肾精亏虚，气血亏虚，髓减脑消，治以滋养肝肾、补益气血为主，佐以化痰、行气、活血［5］。中药黄精是补肾益气的要药，其性甘、平，亦可以调理心肺［6］，首见于《雷公炮炙论》；枸杞性甘、平，多用于滋补肝肾，首见于《本草纲目》。两者作为治疗糖尿病的常用药［7］，也可组成药方，源自《奇效良方卷之二十一·诸虚门》，称为二精方，可以有效缓解神经退行性病变［8］，因此黄精－枸杞药对可以作为糖尿病合并认知功能障碍的重要治疗方药。同时药理学研究表明，黄精提取物具有保护肝肾功能、调节血糖、预防糖尿病并发症的作用［6］，枸杞提取物具有降血糖、调血脂肪、抑制神经细胞凋亡［9-10］等多种药理作用，两者配伍可以更好地防治糖尿病合并认知功能障碍，但其具体的作用机制尚不明确。

本文基于网络药理学技术研究对黄精－枸杞药对防治糖尿病合并认知功能障碍的潜在活性成分和作用靶点，进一步阐明其作用机制，并通过分子对接技术将黄精－枸杞药对内化合物与受体虚拟分子结合发现其作用靶点和结合位点，为其治疗糖尿病合并认知功能障碍提供更多可信度和实验研究基础。

1 资料与方法

1.1 黄精－枸杞药对活性成分筛选及药物靶点收集

通过检索中药系统药理学数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），获取黄精－枸杞的活性成分，并将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）设置为≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18进一步筛选出黄精－枸杞药对的有效活性成分和作用靶点。再利用数据库Uniprot将筛选出的靶点蛋白转换为人类基因名。

1.2 DCI相关靶点的收集

以“Cognitive impairment of diabetes mellitu”为关键字在GeneCards、OMIM、PharmGkb 数据库中进行相关基因的汇总并筛选、删除重复基因。从GeneCards 数据库筛选出的相关基因中进一步筛选出相关分数（Relevance scored）≥1分的靶点基因。

1.3 中药调控网络及蛋白互作网络（PPI）的构建

运用R语言汇总分析中药靶基因与疾病相关基因的交集，并绘制Venny 图。通过软件Cytoscapes 将黄精－枸杞的中药成分与其靶基因的关系进行可视化，形成中药调控网络，其中基因节点越大代表与基因相关的药物成分的数目越多。在STRING 平台导入中药靶基因与疾病相关基因的交集，在“Homo sapiens”属性下，将minimun required interaction score 设置为≤0.9并删除游离的基因，构建蛋白互作网络。再利用CytoNCA 软件计算中药靶基因与疾病相关的交集基因的BC、CC、EC、DC、LAC、NC 分数，构建子网络进一步筛选出PPI网络的核心基因。

1.4 GO和KEGG分析

通过metascape 对数据进行GO 和KEGG 数据分析，颜色越红说明网络中基因在GO 富集中越显著。GO 富集分析的目的在于分析调控网络中的基因行使的功能。KEGG 富集分析的目的在于观察调控网络基因参与的通路。

1.5 分子对接

将核心基因与临床阳性药物利拉鲁肽（Liraglutide）和核心活性成分的小分子配体进行分子对接，在pubchem 网站获取小分子配体的2D 结构，利用Chem 3D 软件生成3D 结构并优化。然后利用Uniprot 搜索基因的蛋白并在PDB 网站获取目标基因蛋白的三维结构，保存为PDB 格式。利用PYMOL 软件去除蛋白受体三维结构的水分子和小分子配体。接着，通过Autodock Tools 给蛋白受体加氢并确定活性口袋，最后，利用活性口袋中心区域的数值，在vina 下进行分子对接并通过Pymol进行可视化。

2 结果

2.1 黄精－枸杞子药对的活性成分及其相关靶点

通过TCMSP 数据库检索及相关条件的筛选后得到黄精的活性成分12个，其相关作用靶点为148个，枸杞的活性成分45个，其作用靶点为364个。见表1。

表1 黄精－枸杞药对活性成分

2.2 黄精－枸杞子药对治疗DCI作用靶点的筛选

通过数据库GeneCards、OMIM、PharmGkb 数据库检索出疾病相关基因，通过https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/网站筛选出黄精－枸杞子药对的潜在靶点与疾病相关靶点的交集并生成韦恩图，见图1，其中紫色为药对相关基因，有196 个靶点基因，红色为DCI相关基因为5 554个，两者有167个共同的靶点基因。

图1 疾病与药物相关靶点的Venny图

2.3 黄精－枸杞子药对活性成分治疗DCI 的中药调控网络

将中药靶基因与疾病相关基因的交集导入Cytoscapes 软件构建中药调控网络（见图2），圆圈为中药的成分其中绿色为枸杞子的活性成分，黄色为黄精的活性成分，矩形的蓝色部分代表中药的靶基因，蓝色节点越大代表与基因相连的成分越多。槲皮素（quercetin）所间接的基因最多（122），有效活性成分较高，其次是黄芩素（baicalein）（25）、β－谷甾醇（betasitosterol）（24），β－谷甾醇是黄精、枸杞子公共的有效活性成分。

图2 黄精－枸杞药对靶基因与DCI相关基因的中药调控网络

2.4 构建蛋白互作网络（PPI网络）

在STRING 平台导入数据，将最低相互评分设置为≤0.9，构建蛋白互作网络见图3，其PPI 网络包涵618 条边，167 个节点，浅蓝色和紫红色连线为已知的相互作用，绿色、深蓝色和红色连线为预测的相互作用。通过CytoNCA 软件进一步计算筛选出PPI网络中的13 个核心基因，见图4，共有13 个节点，56 条边。 基于degree分数，取前三为JUN（degree23）、MAPK1（degree23）、TP53（degree25），为分子对接做准备。

图3 PPI蛋白互作网络

图4 核心基因的蛋白互作网络

2.5 KEGG和GO富集分析

进行KEGG 富集分析（P< 0.05）可得到条目163条，可涉及的信号通路有AGE－RAGE 信号通路（AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications）、癌症信号通路（Pathways in cancer）、前列腺癌信号通路（Prostate cancer）等，见图5。基于metascape 进行GO 富集分析（P<0.05），X 轴为涉及的基因数，Y 轴为按P值大小排列的BP、CC、MF 名称。其中生物学过程（BP）包括对有毒物质的反应（response to toxic substance）、氧化应激反应（response to oxidative stress）、对伤害的反应（response to wounding）等，细胞成分（CC）涉及膜筏（membrane raft）、胞质核周区（perinuclear region of cytoplasm）、突触后（postsynapse）等，分子功能（MF）包括转录因子结合（transcription factor binding）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）、蛋白结构域特异性结合（protein domain specific binding）等，见图6。其中AGE－RAGE信号通路为rich factor 最高的通路即富集程度较高的通路，癌症通路为富集程度最显著的通路（见图7），其中红色为上调差异基因，绿色为下调差异基因。

图5 KEGG富集分析通路图

图6 GO富集分析图

图7 ACE-RACE信号通路

2.6 分子对接

基于Drugbank数据库与PPI网络可获得黄精－枸杞药对的核心活性成分为黄芩素、槲皮素、β－谷甾醇，基于核心靶点为JUN、MAPK1、TP53。分别将两者进行分子对接，研究结果见表2。结合能<－5 kcal/mol表示分子对接结果良好［11］。黄芩素、槲皮素、β－谷甾醇与靶点JUN、MAPK1、TP53分子对接的结合能都低于－20.5 kJ/mol，其中JUN与槲皮素结合能最低，为－30.96 kJ/mol（见图8），MAPK1与β－谷甾醇结合最稳定，结合能－36 kJ/mol（见图9），TP53 与槲皮素结合最稳定，结合能为－37.24 kJ/mol（见图10），表明黄精－枸杞药对的核心活性成分与糖尿病合并认知功能障碍核心靶点的分子对接结果良好。

图8 JUN与quercetin

图9 TP53与quercetin

图10 MAPK1与beta－sitosterol

表2 黄精－枸杞药对的核心活性成分与核心靶点的分子对接结果（kJ/mol）

3 讨论

中医古籍中并没有糖尿病合并认知功能障碍的病名记载，但是根据其临床表现可以将其归属于“痴呆”合并“消渴”的范畴，正如《圣济总录》提到“消渴日久，怔忡健忘”［12］。其病因在于肾精不足，肾阳虚衰，不能温化水液，水液潴留，化湿为痰或肾气不足，血行不畅，留滞为瘀，痰瘀日久，阻滞脑络，脑为百神之会，脑络受损则出现意识活动障碍［13］。徐虎军［14］将糖尿病合并认知功能障碍的患者辨为阴虚阳亢证、气血不足证、腑滞浊留证、热毒内盛证和肾精亏虚证，研究表明糖尿病合并认知功能障碍为肾精亏虚证占80%，两证相兼者占80.8%，三证及以上占57.3%，故治疗多以补肾为主，加以行气、化痰、活血，标本兼顾［5］。黄精－枸杞药对作为补益肾精的常用药对［15-16］还可以达到改善血糖［17］、保护神经细胞的作用［8］。王旭教授在通过多年的临床研究观察中总结出“糖脂清”方对于糖尿病合并认知功能障碍的患者疗效显著，黄精、枸杞作为其君药起着主要的治疗疾病的作用。但目前对于黄精－枸杞药对治疗糖尿病合并认知功能障碍的药理学研究较少，因此本研究对黄精－枸杞药对治疗糖尿病合并认知功能障碍的作用机制、作用靶点进行了深入的分析。

基于《全球糖尿病概览》（第八版）［18］，我国糖尿病人数为全球第一。随着对于糖尿病合并认知功能障碍疾病的深入研究，已有研究表明［19］，糖尿病患者由于体内葡萄糖浓度的升高导致ROS 生成增加、TLR4 通路激活、炎症介质释放；在持续的炎症反应下，出现巨噬细胞等免疫因子浸润，进而导致胰岛功能障碍，形成恶性循环。小胶质细胞是中枢神经系统的组织巨噬细胞，参与神经炎症［20］，是大脑的先天免疫细胞，与神经退行性改变密切相关［21］。Teemu Natunen 等进一步研究证实［22］，糖尿病会诱导小鼠海马体中与神经退行性改变相关的小胶质细胞特异基因的异常表达。同时，免疫细胞分泌的IFN－细胞因子等免疫活性分子过表达CPR 等也会导致神经元受损，认知功能出现退行性改变［23］。此外，研究表明［24］糖尿病合并认知功能障碍可能与Ca2+失调、血脑屏障受损、糖尿病脑损伤、免疫炎症机制、胰岛素功能受损有关。这对于研究中药治疗糖尿病合并认知功能障碍具有较大的意义。

本研究通过TCMSP平台筛选出黄精－枸杞的有效成分12个，通过PPI网络获得与糖尿病合并认知功能障碍相关靶基因关联性较强的药物活性成分主要有黄芩素（baicalein）、β－谷甾醇（beta－sitosterol）、豆甾醇（stigmasterol）、槲皮素（quercetin）等。槲皮素、黄芩素作为黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、降糖等作用，对神经退行性疾病［25］及2型糖尿病［26］等多种疾病疗效显著。黄酮类化合物与MAPK1激酶相互作用还可以保护神经，增强记忆功能［27］。研究表明［28］，黄芩素可以通过改善高糖诱所导致的血脑屏障受损达到保护糖尿病中枢神经系统的作用。槲皮素最显著的作用在于抑制炎症因子，降低氧化应激反应，调节炎症反应［29］。β－谷甾醇和豆甾醇都属于类固醇，又可以称为“肾上腺皮质素”，可以有效抗高胆固醇、神经细胞炎症，提高抗氧化和调节血糖［30-31］。

黄精－枸杞药对与糖尿病合并认知功能障碍的交集基因共有164 个，主要作用靶点有JUN（AP－1）、FOS、MAPK1、MYC、TP53 等。转录调节因子JUN（AP－1）、FOS 是转录因子激活蛋白－1（AP－1）家族的成员，参与调控T 淋巴细胞等多种细胞的产生、增殖、活化［32］。研究表明［33］，JUN（AP－1）可以激活小胶质细胞和促进巨噬细胞炎症活化。AP－1上游的调控因子JNK 磷酸化C－Jun 蛋白参与MAPK 级联反应是产生炎症反应的重要途径［34］。DENG Y 等［35］通过抑制MAPK1可以有效减少海马细胞的凋亡，改善认知功能障碍。癌基因MYC、肿瘤蛋白TP53 同属于控制凋亡调节蛋白表达的转录因子，主要作用于调控细胞的生长、增殖、凋亡［36］，C－myc 有助于抑制神经毒性［37］，N－myc下游调控系统通过增加MMP－3的表达和分泌，调节血脑屏障和免疫细胞的渗透性［38］，可涉及多种神经系统疾病的发病机制［39］。LACROIX M 等［40］实验发现，TP53 既可以参与胰岛β 细胞凋亡，胰岛素抵抗，氧化应激等与糖尿病相关的生物过程，也参与调控FXN，进而导致神经细胞的凋亡，与糖尿病合并认知功能障碍关系密切。

基于GO和KEGG富集分析，将黄精－枸杞药对治疗糖尿病合并认知功能障碍相关的通路分数排在前20 位的通路分为疾病通路、有机系统通路和环境信息处理通路。疾病通路包括糖尿病并发症AGE－RAGE信号通路、乙型肝炎信号通路、癌症相关通路等。有机系统主要可分为免疫系统（IL－17 信号通路）、神经系统（Dopaminergic synapse）与内分泌系统（脂肪细胞因子信号通路等）。环境信息处理主要为信号传导包括NF－kappa B 信号通路与MAPK 信号通路。其主要的分子过程为与转录因子、蛋白激酶的结合，可知黄精－枸杞药对治疗糖尿病合并认知功能障碍主要涉及神经内分泌免疫网络，是多通路、多靶点的。神经内分泌免疫网络起源于1977年由Basedovsky 提出，与中医整体观，脏腑气血功能不足导致脏腑疾病发生的论点相一致［41］。黄精－枸杞药对治疗糖尿病合并认知功能障主要以补肾为主，肾为先天之本，主藏精，精化气，气生血；精生髓，髓化血，气血不足，脏腑功能衰退，脑络不荣，认知功能衰退。药对通过治疗神经炎症、胰岛素抵抗、炎症反应等，立足于神经内分泌免疫网络，可以有效治疗糖尿病合并认知功能障碍。

综上所述，本研究发现黄精－枸杞药对治疗糖尿病合并认知功能障碍有效成分主要为黄芩素、β－谷甾醇、豆甾醇和槲皮素，主要作用于靶点JUN、MAPK1、TP53、FOS，参与免疫、信号传导、病毒相关的多种通路，立足于神经内分泌免疫网络，具有良好的抗炎、调节免疫、修复血脑屏障的作用。但本研究尚存在一些不足之处，在后续的实验研究中也需要进一步验证黄精－枸杞药对治疗糖尿病合并认知功能障碍的有效靶点和通路，以便更好地进行对疾病的防治工作。