基于生物信息学筛选尿毒症差异基因及中药预测

林帅军，杨忠杰，荣晓哲，杜跃亮，王瑞，于晓涛

（漯河市第一人民医院，河南 漯河 462005）

在全球范围内有超过200 万人是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者［1］。尿毒症（uremia）是指与慢性肾脏病（CKD）患者全身器官功能障碍相关的各种临床综合征，导致许多蛋白质结合和水溶性代谢物（称为尿毒症溶质）在血浆中积聚、多器官功能障碍和肠道菌群失调等［2］。

目前尿毒症的主要治疗手段是肾移植或血液透析，由于肾源稀少，大部分患者选择透析治疗。血液透析可清除慢性肾衰竭患者体内毒素，使患者生存质量显著提升，但是长时间的血液透析不仅会出现并发症，还会影响患者的预后［3］。但是血液透析对于净化患者体内内源及外源性毒素的具有较好效果，但并不能改善患者的肾功能［4］，而中医药不仅可改善患者的生存质量，调节肾脏血液循环，提高肾小球滤过率，并且提高了患者的肾功能，因此可被用于辅助治疗慢性肾衰竭患者［5］。

近年来基因芯片技术与高通量技术可测量人类基因组内多个基因的表达变化，被广泛应用于疾病过程和生物功能障碍的分子途径的阐明以及药物治疗靶点的筛选［6－7］。本研究利用基因表达数据库（GEO）检索尿毒症基因芯片，对数据进行分析并筛选尿毒症组与正常组的差异表达基因，通过构建差异基因蛋白互作网络进而发现关键基因，对关键基因进行GO 功能分析和KEGG 通路分析，明确关键基因主要涉及通路，依托Coremine Medical 数据库筛选以关键基因为靶点的潜在治疗中药，以期为尿毒症的分子机制及潜在治疗中药提供新研究思路及理论依据。

1 资料与方法

1.1 数据提取

从基因表达数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载编号为GSE37171 的基因片段原始数据［8］。该数据集包括年龄在18至75岁之间、临床稳定等待肾移植、未接受免疫抑制药物治疗的5 期肾病患者75 个和40 个正常人外周血的基因芯片数据，该片段平台为GPL570［HG－U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。

1.2 数据处理

基于R 语言（https：//www.r－project.org/）“limmar”包对尿毒症患者外周血和正常人外周血样品中每个探针进行数据归一化，对于一个基因对应多个探针的，合并多个探针并取其平均值，对样本标准化的结果采用箱式图和主成分分析图查看。

1.3 差异基因

通过R 语言中与GPL570 平台相对应“hgu133plus 2. db”包将探针转换成基因名称，并且以log2（fold change）的绝对值> 1 和调整的P< 0.05 为筛选标准，筛选差异表达基因（DEGs），负数代表下调，正数代表上调，利用R语言“ggpubr”和“pheatmap”包制作差异表达基因的火山图和热图。

1.4 筛选关键基因

利用String数据库［9］（https：//string－db.org/）以medium confidence>0.4为筛选条件对DEGs进行蛋白质相互作用（PPI）分析，利用Cytoscape 软件（version3.7.2）的CytoHubba 插件对PPI 互作网络进行差异基因筛选以获得关键基因，具有高degree 的蛋白更倾向于是关键蛋白，因此以degree 对节点进行排名综合筛选关键基因。

1.5 关键基因的功能注释

利用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对关键基因进行基因功能富集分析。使用kobas 数据库（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）［10］以P< 0.05 作为显著性富集筛选标准对关键基因进行KEGG 通路富集分析。

1.6 基于Coremine Medical数据库的中药筛选

将关键基因导入Coremine Medical 数据库（http：//www.coremine.com/）中，基因和对应药物映射以P<0.05筛选具有潜在治疗作用的中药。

2 结果

2.1 数据预处理

对GSE37171 的基因片段原始数据过滤后最终获取20864 个基因表达水平数据。样本标准化箱式图结果显示肾病患者和正常人外周血样本中位数在一个水平线上，说明样本间归一化程度好，见图1A。PCA 图显示uremia 和正常组外周血样本表达基本能够区分，见图1B。

图1 GSE37171数据质量分析

2.2 差异基因结果

对GSE37171 的基因片段原始数据探针转化后，以log2（Fold change）的绝对值> 1 和调整的P< 0.05为筛选标准，总共得出571 个差异表达基因，其中包括526 个上调基因和45 个下调基因，差异表达基因的火山图见图2；下调和上调最显著40 个基因的聚类热图见图3。

图2 DEGs火山图

图3 DEGs聚类热图

2.3 差异表达基因的PPI 网络模块分析及关键基因筛选

基于STRING 数据库的PPI分析得到了uremia组显著差异基因的PPI网络，总共543个节点，1 258个互作关系。基于Cytoscape的CytoHubba插件对PPI网络各个节点基因进行评分排序，得到网络中的核心节点基因。使用Degree 算法计算出的15 个关键基因为EP300、UBE2D1、SIRT1、PPP2CA、RANBP2、SMARCA5、DHX15、TLR4、UBE2E2、SRSF2、UBE2E1、RBBP4、DDX5、YWHAZ和CDKN1B，数据见表1，关键基因模块见图4。

图4 关键基因互作关系网络

表1 差异表达基因中Degree排名前15的基因

2.4 关键基因GO功能富集和KEGG通路分析

使用DAVID 对关键基因进行GO 分析。GO 分析结果显示差异基因主要参与的生物过程（BP）为K48蛋白连接泛素化、细胞对热反应的调节、细胞生长的负调控、ISG15－蛋白结合、RNA 拼接；细胞成分（CC）：核浆、核、NURF 复合体、染色质沉默复杂、ESC/E（Z）复合体；分子功能（MF）：蛋白结合、泛素结合酶活性、ISG15转移酶活性、组蛋白结合、ATP结合。见图5。

图5 关键基因的GO 富集分析

Kobas富集分析（P<0.05）共筛选出15条通路，涉及PI3K－Akt 信号通路、HIF－1 信号通路、细胞周期、FoxO 信号通路、剪接体、泛素介导的蛋白水解途径、乙型肝炎、小分子核糖核酸在癌症、人类乳头瘤病毒感染、TGF－beta信号通路、胰高糖素信号通路、AMPK信号通路、卵母细胞减数分裂、Hippo信号通路和细胞衰老等，通路见图6。

图6 关键基因KEGG 富集通路图

2.5 关键基因治疗中药预测结果

将10 个关键基因映射到Coremine Medical 数据库，以P< 0.05 为条件筛选治疗Uremia 的潜在中药，得到黄芪、钩藤、黄芩、人参、积雪草等多味中药，见表2。

表2 关键基因相关中药预测表

3 讨论

3.1 尿毒症患者和健康人之间的差异表达基因

尿毒症预后差、花费高，目前糖皮质激素、免疫抑制药物及透析治疗尚存在不良并发症，而中医药在辨证论治的基础上，整体调治慢性肾病已取得明显的疗效。各种慢性肾病的病理基础是肾小球硬化、肾间质纤维化和肾动脉硬化，而在慢性肾病发展过程中，肾组织的炎症反应及其相关的组织损伤是导致其进展至终末期肾病尿毒症的重要因素。

研究显示健康和疾病中的肾功能中EP300的靶基因可作为未来实验研究的靶基因，以阐明将差异DNA甲基化与肾功能联系起来的潜在基因调控机制［11］。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）表达受到抑制，可造成小鼠肾小球系膜细胞凋亡。研究表明，SIRT1 通过调节肾脏细胞的氧化应激状态，抑制肾脏细胞凋亡和肾脏炎症反应，从而缓解糖尿病肾病［12］。Toll 样受体4（Toll‐like receptors，TLR4）属Toll 样受体家族，是一种膜型模式识别受体，TLR4活化后可诱导IL－6、IL－8 等多种炎性因子基因并促进趋化因子分泌、巨噬细胞表型转化及氧化应激，是肾纤维化的重要介质［13－14］。

3.2 关键表达基因的功能与缺氧和炎症信号通路密切相关

肾纤维化是具有多种病因的进行性慢性肾病的常见病理标志。作为终末期肾病的最终共同途径，缺氧在肾纤维化发展过程中起着关键作用［15］。研究显示缺氧诱导的肾纤维化中的EMT与PI3K/Akt通路的激活关系密切，抑制PI3K激活通过减弱ECM 的积累，而抑制Akt导致梗阻性肾病中肌成纤维细胞标志物的减少［16－17］。

缺氧诱导因子（HIF）是肾脏疾病各种病理生理过程中缺氧适应反应的主要介质，HIF 可直接诱导缺氧肾小管上皮细胞中基质调节因子的表达，例如胶原蛋白I、纤溶酶原激活剂抑制剂1（PAI1）、内皮素－1（ET－1）、结缔组织生长因子（CTGF）、基质金属肽酶2（MMP－2）和金属蛋白酶1 组织抑制剂（TIMP1），可增加间质胶原蛋白的产生并减少ECM的降解［18－19］。

3.3 相关中药可能是尿毒症预防及治疗的潜在药物

研究显示黄芩苷可以通过抑制miR－141过表达，促进Sirt1表达水平上升以缓解高糖小鼠肾小球系膜细胞的凋亡，进而治疗糖尿病肾病［20］。研究显示汉黄芩素能够通过抑制糖尿病肾病大鼠肾组织TLR4蛋白表达水平，减轻大鼠肾组织氧化应激损伤及炎症反应，进而恢复肾小球形态及功能，显著改善糖尿病肾病的肾功能［21］。益肾胶囊（黄芪、当归等组成）可上调SOCS－3而抑制TLR4 与IL－6 表达，从而降低糖尿病肾病的炎症反应［22］。中药可通过调控炎性因子及其信号通路而干预慢性肾病的发展，后期通过科学完整的药物筛选平台必将产生安全有效的治疗慢性肾病的中药制剂。

通过对尿毒症基因芯片的数据挖掘及生物信息学分析，发现尿毒症的差异表达基因，筛选得到15个关键基因，分析得到关键基因主要参与的信号通路及其功能，发现黄芪、钩藤、黄芩、人参、积雪草等可能是其潜在的治疗中药。所筛选的关键基因及中药可为后续尿毒症分子机制及其治疗药物的研究研究提供理论依据，未来需进一步通过实验来验证关键基因及相关中药的治疗作用。