基于p38 MAPK通路探讨盘龙七片对膝骨关节炎模型大鼠的治疗作用与可能机制

时超，谭亮*，孙春生，陈继平，孟建国

（1. 南京中医药大学附属徐州市中医院，江苏 徐州 221003；2. 陕西盘龙药业集团股份有限公司，陕西 西安 710025）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是骨科的常见疾病［1］。KOA 发病率及致残率正呈逐年增长趋势，预计到2030年，欧洲及美国将有1/5 的人口罹患KOA［2］。目前研究认为，关节软骨异常炎症反应是导致KOA 患者关节组织发生病变的重要原因之一［3］。p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）信号通路可介导炎症通路活化，并参与KOA的发生、发展过程［4］。

盘龙七片可活血化瘀、祛风除湿、消肿止痛，临床上常用于治疗风湿性关节炎、腰肌劳损、骨折及软组织损伤等［5］。近来研究发现，盘龙七片可通过抑制软骨细胞凋亡、抑制炎症因子释放从而治疗KOA［6］，但盘龙七片抑制软骨细胞凋亡和促炎因子释放的具体分子生物学机制尚不明确。本研究基于p38 MAPK信号通路，探讨盘龙七片对KOA模型大鼠软骨组织病变的影响与可能的分子生物学机制，以期为临床合理用药提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物

清洁级SD雄性大鼠60只，体质量200～220 g，6～7 周龄，购自于斯贝福（北京）实验动物科技有限公司，批号：SCXK（京）2016－0002。所有大鼠于本院动物房中饲养，实验动物遵循3R原则。

1.1.2 主要试剂及仪器

盘龙七片（陕西盘龙药业集团股份有限公司，批号：20190320005）；茴香霉素（上海信裕生物科技有限公司，货号：XY－01323）；HE 染色试剂盒（上海生物公司，货号：E677218－0200）；肿瘤坏死因子（TNF－α）及白细胞介素－1β（IL－1β）等ELISA 试剂盒（上海振誉生物科技有限公司、上海心语生物科技有限公司，货号：EL－R0019、SY－2235）；p38 MAPK 磷酸化蛋白（pp38 MAPK）、核转录因子κB（NF－κB）磷酸化蛋白（p－NF－κB）等兔抗大鼠免疫组化用抗体（货号：ab4822、ab194726）、Ⅱ型胶原（COL2）（货号：ab168356）、解聚蛋白样金属蛋白酶－4（ADAMTS－4，货号：ab84792）、基质金属蛋白酶－13（MMP－13，货号：ab51072）、水通道蛋白3（AQP3，货号：ab125219）、凋亡蛋白－半胱天冬酶（Caspase－3，货号：ab184787）抗体等（美国abcam 公司）；SMZ745光学显微镜（日本尼康公司）。

1.2 方法及观察指标

1.2.1 大鼠分组、建立KOA模型及给药

全部60 只SD 大鼠按随机数字表分为正常对照组、模型组、盘龙七片组、p38 MAPK 抑制剂组（SB203580 组）、p38 MAPK 激动剂组（茴香霉素组）和盘龙七片+茴香霉素组，每组各10只。除正常对照组外，对其余各组大鼠进行造模。参照文献［7］方法取大鼠，麻醉后用1 mL 注射器将50 μLⅡ型胶原酶溶液于右后侧膝关节处注入关节腔内，4 d 后重复上述操作，7 d 后观察大鼠行为变化，若大鼠右后肢出现收缩、跛行等现象，视为造模成功。正常对照组大鼠则于关节腔内注射等体积的生理盐水。

参照文献［7］设置盘龙七片组给药剂量为1.29 g/kg（相当于成人等效剂量的10 倍），将盘龙七片用生理盐水稀释成浓度为0.129 g/mL 混悬液，按10 mL/kg 灌胃给药；参照文献［8］设置茴香霉素组及SB203580 组给药剂量分别为5 mg/kg 和10 μL/只，茴香霉素及SB203580 均于大鼠右后肢膝关节处经皮下注射给药，每3日注射1 次；盘龙七片+ 茴香霉素组大鼠给予盘龙七片混悬液10 mL/kg 灌胃，同时膝关节皮下注射茴香霉素溶液10 μL/只；正常对照组与模型组大鼠灌胃等量生理盐水，各组均连续给药14 d。

1.2.2 大鼠一般行为观察及LequesneMG行为学评分

末次给药并禁食禁水12 h 后，观察各组大鼠局部按压疼痛反应、步态等行为学变化，并参照文献［9］进行LequesneMG 行为学评分。评分时，由同一名不知情的非本实验人员进行评分并记录总分，各组大鼠取总分平均值进行比较。

1.2.3 大鼠膝关节肿胀程度测量及病理变化

采用电子数字显示游标卡尺测量大鼠膝关节直径，评估膝关节肿胀情况。麻醉处死大鼠，解剖膝关节，肉眼观察关节病理变化。

1.2.4 HE染色检测软骨组织病理变化

迅速剥离并取出大鼠右后肢整个膝关节软骨组织，剪取部分组织置于－80 ℃冰箱中保存，剩余软骨组织迅速置于4%中性多聚甲醛中固定24 h 后，用乙二胺四乙酸溶液脱钙处理并制备成5 μm切片，取部分切片按HE 试剂盒说明书进行染色，光镜下观察组织形态变化。参照文献［10］用Mankin's评分表对组织病理损伤程度进行评分。

1.2.5 免疫组化染色法检测软骨组织中p－p38 MAPK、p－NF－κB表达水平

取剩余软骨组织石蜡切片，脱蜡及抗原修复后，加入一抗抗体（p－p38 MAPK、p－NF－κB，1∶800）4 ℃孵育过夜，后加入羊抗兔二抗（1∶1 000）室温孵育4 h，DAB 显色，苏木精复染、封片后，于光镜下观察拍照，用Image Pro Plus 5.0图像分析系统分析单位面积阳性染色区的平均光密度值。

1.2.6 ELISA 法检测软骨组织中炎性因子IL－1β、TNF－α水平

取“1.2.4”中保存于－80 ℃的软骨组织，4 ℃解冻后，冰上匀浆，3 000 r/min 离心分离15 min 后，取匀浆液，按ELISA 试剂盒说明书方法检测IL－1β、TNF－α水平。

1.2.7 Western Blot 法检测AQP3、Caspase－3、COL2、ADAMTS－4、MMP－13和IL－1β蛋白相对表达水平

取“1.2.6”中剩余匀浆液，用蛋白提取及BCA 法提取并测蛋白总浓度后，取50 μg 蛋白上样，进行电泳和转膜反应，加入一抗抗体（AQP3、Caspase－3、COL2、ADAMTS－4、MMP－13、IL－1β、β －actin 内 参，1∶1 000）4 ℃摇床孵育过夜，后加入HRP 羊抗兔二抗（1∶2 000），室温孵育1 h，用增强化学发光法显色，以化学发光仪观察条带并拍照，以Image－J 软件分析测定蛋白相对表达。

1.3 统计学分析

采用SPSS22.0 软件对所得实验数据进行统计学分析，以均数±标准差（±s）表示计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较行SNK－q检验，P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学评分结果比较

正常对照组大鼠跑动正常，无跛行。与正常对照组相比，模型组大鼠右后肢收缩痉挛、跛行明显，行为学评分升高（P< 0.05）。与模型组相比，盘龙七片组及SB203580 组大鼠跛行明显改善，行为学评分降低（P<0.05）；茴香霉素组大鼠右后肢跛行严重，大部分不能参与行走，行为学评分升高（P<0.05）；而盘龙七片+ 茴香霉素组上述指标变化与盘龙七片组相反（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠行为学评分结果（±s，分）

表1 各组大鼠行为学评分结果（±s，分）

注：与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；与盘龙七片组比较，△P<0.05。

组别正常对照组模型组盘龙七片组SB203580组茴香霉素组盘龙七片+茴香霉素组n 10 10 10 10 10 10行为学评分0.02±0.00 4.08±0.04*2.02±0.02#2.02±0.02#5.53±0.04#△4.03±0.04△

2.2 各组大鼠膝关节肿胀程度及大体观察结果比较

正常对照组大鼠膝关节情况正常。与正常对照组相比，模型组大鼠膝关节肿胀，关节软骨无光泽，色稍黄，关节液增多，软骨表面裂纹、糜烂及溃疡增多，膝关节直径增大（P< 0.05）。与模型组相比，盘龙七片组及SB203580组大鼠右后肢膝关节软骨表面粗糙，呈毛刺状，部分出现裂纹、糜烂及溃疡，膝关节直径减小（P< 0.05）；茴香霉素组大鼠右后肢膝关节软骨表面裂纹、糜烂及溃疡增多，且部分直达骨质，软骨下骨暴露较多，膝关节直径升高（P<0.05）；盘龙七片+茴香霉素组上述指标变化与盘龙七片组相反（P< 0.05）。见图1、表2。

图1 各组大鼠膝关节损伤大体观察图

表2 各组大鼠膝关节直径检测结果（±s，mm）

表2 各组大鼠膝关节直径检测结果（±s，mm）

注：与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；与盘龙七片组比较，△P<0.05。

组别正常对照组模型组盘龙七片组SB203580组茴香霉素组盘龙七片+茴香霉素组n 10 10 10 10 10 10膝关节直径11.02±0.15 12.98±0.16*11.03±0.13#11.12±0.14#13.53±0.16#△12.93±0.16△

2.3 各组大鼠软骨组织HE染色结果比较

正常对照组大鼠软骨组织无明显病理学改变。与正常对照组相比，模型组大鼠软骨组织坏死脱落，原有结构及潮线破坏，坏死区残留少量软骨细胞，有大量纤维组织增生，Mankin's评分升高（P<0.05）。与模型组相比，盘龙七片组及SB203580组大鼠软骨表面局部粗糙不平、溃疡减少，移行层水肿、变形，在坏死区两侧可见软骨基质，染色不一，Mankin's评分降低（P<0.05）；茴香霉素组软骨组织坏死脱落现象增多明显，Mankin's评分升高（P<0.05）；盘龙七片+茴香霉素组上述指标变化与盘龙七片组相反（P<0.05）。见表3、图2。

图2 各组大鼠软骨组织HE染色结果（×200）

表3 各组大鼠病理损伤程度Mankin's评分结果（±s，分）

表3 各组大鼠病理损伤程度Mankin's评分结果（±s，分）

注：与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；与盘龙七片组比较，△P<0.05。

组别正常对照组模型组盘龙七片组SB203580组茴香霉素组盘龙七片+茴香霉素组n 10 10 10 10 10 10 Mankin's评分1.02±0.19 7.68±0.26*4.93±0.23#5.02±0.24#8.53±0.25#△7.66±0.26△

2.4 各组大鼠软骨组织IL－1β、TNF－α水平结果比较

与正常对照组相比，模型组大鼠软骨组织IL－1β、TNF－α 水平升高（P< 0.05）。与模型组相比，盘龙七片组及SB203580 组大鼠软骨组织IL－1β、TNFα水平降低（P<0.05）；茴香霉素组大鼠软骨组织IL－1β、TNF－α 水平进一步升高（P<0.05）；盘龙七片+茴香霉素组上述指标变化与盘龙七片组相反（P<0.05）。见表4。

表4 各组大鼠软骨组织IL－1β、TNF－α水平比较（±s，n=10）

表4 各组大鼠软骨组织IL－1β、TNF－α水平比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；与盘龙七片组比较，△P<0.05。

组别正常对照组模型组盘龙七片组SB203580组茴香霉素组盘龙七片+茴香霉素组IL－1β（pg/g）148.32±14.98 326.58±17.95*184.86±16.52#185.62±15.04#487.63±17.25#△325.13±17.93△TNF－α（pg/g）29.46±5.91 102.08±8.03*46.07±7.21#48.96±6.04#192.99±9.33#△101.39±8.02△

2.5 各组大鼠软骨组织p－p38 MAPK、p－NF－κB阳性表达结果比较

免疫组化染色结果显示，正常对照组大鼠软骨组织中p－p38 MAPK、p－NF－κB 呈弱阳性表达。与正常对照组相比，模型组大鼠软骨组织中p－p38 MAPK、p－NF－κB 阳性表达升高（P<0.05）。与模型组相比，盘龙七片组及SB203580 组大鼠p－p38 MAPK、p－NF－κB 阳性表达降低（P< 0.05）；茴香霉素组软骨细胞p－p38 MAPK、p－NF－κB 阳性表达进一步升高（P<0.05）；盘龙七片+茴香霉素组上述指标变化与盘龙七片组相反（P<0.05）。见图3、表5。

表5 各组大鼠软骨组织p－p38 MAPK、p－NF－κB阳性表达比较结果（±s，n=10）

表5 各组大鼠软骨组织p－p38 MAPK、p－NF－κB阳性表达比较结果（±s，n=10）

注：与正常组比较，*P < 0.05；与模型组比较，#P < 0.05；与盘龙七片组比较，△P<0.05。

组别正常对照组模型组盘龙七片组SB203580组茴香霉素组盘龙七片+茴香霉素组p－p38 MAPK（平均光密度/mm2）0.32±0.03 2.08±0.21*1.03±0.13#1.02±0.14#2.83±0.22#△2.06±0.21△p－NF－κB（平均光密度/mm2）0.22±0.02 2.17±0.20*1.33±0.13#1.32±0.14#2.96±0.23#△2.19±0.20△

图3 各组大鼠软骨组织p－p38 MAPK、p－NF－κB阳性表达染色结果（×400）

2.6 各组大鼠软骨组织COL2、ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3蛋白表达结果

与正常对照组相比，模型组大鼠软骨组织中ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3 蛋白表达升高（P< 0.05），COL2 蛋白表达降低（P< 0.05）。与模型组相比，盘龙七片组及SB203580 组大鼠ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3 蛋白表达均降低（P<0.05），COL2 蛋白表达升高（P<0.05）；茴香 霉 素 组 大 鼠 ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3 蛋白表达升高（P< 0.05），COL2 蛋白表达降低（P< 0.05）；盘龙七片+ 茴香霉素组上述指标变化与盘龙七片组相反（P<0.05）。见图4、表6。

表6 各组大鼠软骨组织ADAMTS－4、MMP－13、COL2、AQP3、Caspase－3蛋白表达比较（±s，n=10）

表6 各组大鼠软骨组织ADAMTS－4、MMP－13、COL2、AQP3、Caspase－3蛋白表达比较（±s，n=10）

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与盘龙七片组比较，△P<0.05。

组别正常对照组模型组盘龙七片组SB203580组茴香霉素组盘龙七片+茴香霉素组ADAMTS－4/β－actin 1.02±0.11 1.86±0.18*1.47±0.12#1.48±0.13#2.09±0.19#1.87±0.18△MMP－13/β－actin 1.16±0.10 1.79±0.17*1.39±0.12#1.40±0.13#2.16±0.20#1.88±0.18△COL2/β－actin 1.11±0.09 0.45±0.05*0.71±0.07#0.79±0.07#0.16±0.01#0.41±0.04△AQP3/β－actin 1.09±0.10 1.99±0.18*1.57±0.12#1.58±0.13#2.46±0.19#1.98±0.19△Caspase－3/β－actin 1.17±0.10 1.75±0.15*1.31±0.13#1.39±0.13#2.16±0.22#1.71±0.17△

图4 各组大鼠软骨组织ADAMTS－4、MMP－13、COL2、AQP3、Caspase－3蛋白表达免疫印迹图

3 讨论

现代医学认为滑膜、软骨等关节组织的退变和破坏是KOA 的主要病机［11］。西医治疗KOA 费用昂贵且效果不甚明显，寻找经济简便的治愈膝骨关节炎方法尤为重要［11］。SD 大鼠膝关节腔内注射Ⅱ型胶原蛋白酶，可成功建立早期KOA 模型［12］。本研究成功建立SD 大鼠KOA 模型后发现，KOA 大鼠右后肢痉挛收缩等行为严重、膝关节肿胀程度增加，肉眼观察可见关节软骨无光泽、关节液增多，光镜观察可见软骨组织坏死、纤维组织增生、炎性浸润等病理损伤，软骨组织IL－1β、TNF－α 等炎性因子分泌增加。中医学将KOA 归属于“骨癖”“膝痹”“鹤膝风”等范畴，并认为KOA 病机为“虚”“邪”“瘀”所致，风寒湿毒蓄积于骨节、四肢、髓间，是造成患者痛如虎噬的主要原因，针对KOA 的病因，宜采用活血化瘀疗法改善患者疼痛症状［13］。盘龙七片由龙七、当归、壮筋丹、丹参、五加皮等29 味中草药组成，具有活血化瘀、消肿止痛的功效，对慢性炎性疼痛类疾病有较好的治疗作用［14］。本研究发现，经盘龙七片治疗后，大鼠右后肢痉挛收缩、行走困难等行为减少，膝关节肿胀、软骨组织坏死、纤维组织增生、炎性浸润等病理损伤减轻，软骨组织中IL－1β、TNF－α 炎性因子水平降低，提示盘龙七片对KOA 的疗效确切，但其具体的分子生物学机制还不甚明确。

目前研究发现，抑制关节软骨细胞凋亡和炎症反应是缓解KOA 软骨病变的主要机制。p38 MAPK 可直接或间接调控NF－κB 炎性通路活化，诱导TNF－α、IL－1β 等炎性细胞因子释放，促进基质金属蛋白酶如MMP－13 及ADAMTS－4 等表达，导致COL2 降解，引发软骨细胞凋亡，加速KOA 进程［15］。此外，除了介导炎性因子表达和促进细胞炎性损伤，p38 MAPK 还能调控水分子跨膜转运相关蛋白如AQP3 等蛋白表达，破坏细胞内外渗透压平衡，使细胞因吸水膨胀而破裂凋亡［16］。TAN 等［17］及刘欣等［18］发现，通过抑制炎性因子表达或阻断p38 MAPK 激活来下调AQP3 表达，对缓解KOA 软骨退变有重要意义。本研究发现，模型组大鼠软骨组织中的p－p38 MAPK 活化途径被激活，用茴香霉素进一步激活p－p38 MAPK 活化途径后，p38 MAPK 介导的炎性反应及凋亡途径相关通路蛋白即p－NF－κB、ADAMTS－4、MMP－13 及Caspase－3 表达升高，COL2 蛋白表达降低，水通道调控蛋白AQP3等蛋白表达升高，大鼠关节肿胀、软骨组织炎性坏死等KOA 症状进一步加重。反之，阻断p－p38 MAPK 介导的炎性反应及AQP3表达后，大鼠KOA 症状明显缓解，提示p38 MAPK 通路激活，可能是KOA 软骨损伤加重的关键原因之一。盘龙七片组大鼠软骨组织中p38 MAPK/NF－κB/AQP3 通路处于抑制状态，而在p38 MAPK 激动剂茴香霉素的影响下，盘龙七片的上述治疗作用可被逆转。这些结果均提示，盘龙七片发挥KOA 大鼠软骨组织炎性损伤及退变的抑制作用，可能与抑制p38 MAPK/NF－κB/AQP3通路活化有关。

综上所述，盘龙七片可通过抑制p38 MAPK/NFκB/AQP3 通路活化来缓解KOA 大鼠软骨组织炎性损伤症状，这为盘龙七片治疗KOA 可能的分子生物学机制提供了一定的理论依据。但中医药治疗疾病具有多靶点、多途径作用，p38 MAPK 通路还可能与氧化应激及自噬等因素有关，盘龙七片治疗KOA 的其他机制，还有待后续深入研究。