国产人工视网膜视觉假体植入兔眼的短期安全性和稳定性的研究

张赟 陈亦棋 陶继伟 佘相均 董玉桂 沈丽君

视网膜退行性病变是导致视力丧失的主要原因之一，包括年龄相关性黄斑变性和视网膜色素变性，均可造成外层光感受器细胞的破坏，这些损伤的细胞不能传递信号至内层视网膜，导致视功能下降，甚至失明[1-2]。目前尚无有效的方法挽救损伤的视细胞，基因治疗也仅用于RPE65突变的患者[3]，干细胞治疗遇到的成瘤性还有待解决[4]。视觉假体的发展可以避开损伤的光感受器细胞，直接刺激内层视网膜，将视觉信息转化为电信号，产生人工视觉，经过前期的临床实验证实，其具有一定的安全性，并能有效提高患者的视功能[5-6]。

人工视网膜视觉假体主要包括视网膜前假体、视网膜下及脉络膜上腔假体，其中视网膜前假体因具有手术操作空间大、容易散热的优点而被广泛应用[7]。通过长期的临床观察，商用的ArgusⅡ视觉假体能有效改善患者的生活视觉质量，具有广泛的临床应用前景[8]。目前，国外已上市的产品价格昂贵，且无法运用于我国患者，而国内尚无上市的人工视网膜视觉假体产品。本研究拟评估国产人工视网膜视觉假体在兔眼植入后的短期安全性和稳定性，并为其设计、技术改良及临床实验打下基础。

1 材料和方法

1.1 材料 人工视网膜视觉假体试验样品，型号规格：VS-10A；人工视网膜视觉信号处理器，型号规格：NVP-60A，由浙江诺尔康神经电子科技股份有限公司提供。

1.2 实验动物 成年健康白毛黑眼兔10只，雌雄兼用（雌性未产并无孕），右眼为实验眼，购自新昌县大市聚镇欣健兔场，生产许可证：SCXK（浙）2015-0004。饲养于浙江省医疗器械检验院动物中心，普通环境，使用许可证号：SYXK（浙）2014-0016。适应环境时间为5 d。符合GB/T 16886.2《医疗器械生物学评价 第2部分动物福利要求》的规定及其他实验动物福利的相关要求，操作均严格遵守《实验动物管理条例》的相关规定。排除标准：排除有眼球发育异常、视网膜脱离、白内障、视神经发育不良等眼部疾病的兔子。

1.3 手术器械 所有手术均在浙江省医疗器械检验院动物中心完成，手术机器为玻璃体切除及超声乳化吸除一体机（型号：Constellation，美国爱尔康公司）。

1.4 手术植入步骤

1.4.1 术前准备 当日频点氧氟沙星眼药水（日本参天制药株式会社能登工厂，规格：5 ml∶24.4 mg，国药准字：J20100046）于术眼。术前复方托比卡胺滴眼液[参天制药（中国）有限公司，规格：5 ml∶托吡卡胺25 mg，盐酸去氧肾上腺素25 mg，国药准字：H20063360]散瞳、麻醉，全身麻醉后侧卧位放置于手术台上，手术眼与手术台呈水平状。准备人工视网膜生物阻抗监测仪（浙江诺尔康神经电子科技股份有限公司），准备手术。

1.4.2 手术过程

1.4.2.1 背部接收器植入 沿背部正中切开皮肤，钝性分离两侧皮肤及皮下组织，接收器植入皮下。背部接收器植入示意见图1。

图1 背部接收器植入示意图（a：沿背部皮肤正中切开皮肤；b：接收器；c：将接收器植入皮下）

1.4.2.2 导线准备 术眼沿角膜缘360°打开球结膜及筋膜，往上穹窿方向分离眶皮肤，至眉弓，过耳前与背部皮下隧道相连。将背部皮下的接收器导线及电极芯片用保护钳夹取，从隧道内引入眶内结膜下，导线从直肌下环绕眼球至电极芯片拟植入切口部位；10-0缝线固定导线于眼球壁，缝合背部皮肤。导线准备步骤见图2。

图2 导线准备步骤示意图（a：沿角膜缘360°打开球结膜及筋膜；b：背部皮下的接收器导线及电极芯片用保护钳夹取，从隧道内引入眶内结膜下，导线从直肌下环绕眼球至电极芯片拟植入切口部位；c：10-0缝线固定导线于眼球壁，缝合背部皮肤）

1.4.2.3 人工视网膜视觉假体芯片植入 切除术眼晶状体及玻璃体；于植入部位角膜缘后1.5 mm处行巩膜切口，电极植入镊将电极芯片送入玻璃体腔内至后极部，视网膜钉将电极芯片固定；切口缝合并用异体兔巩膜补片覆盖，密闭缝合；缝合手术切口，缝合结膜组织。将人工视网膜视觉假体体外机与植入体连接，测量植入体电极阻抗和通断情况，人工视网膜视觉假体芯片植入步骤见图3。

图3 人工视网膜视觉假体芯片植入步骤示意图（a：植入背部接收器；b：玻璃体切除；c：晶状体切除；d：人工视网膜视觉假体芯片植入；e：异体兔巩膜补片）

1.4.3 术后护理 碘伏消毒皮肤切口1周；40万U青霉素肌肉注射预防术后感染；左氧氟沙星眼药水（可乐必妥）4次/d，滴眼1个月；妥布霉素地塞米松滴眼液4次/d，滴眼1个月；妥布霉素地塞米松眼膏每晚1次，涂眼1个月。伤口愈合后每天将体外机与植入体连接，并开机刺激2 h，连续刺激2个月。

1.5 观察指标

1.5.1 术中观察指标 包括角膜是否透明、视网膜脱离、前房出血、眼内出血、人工视网膜视觉假体电极芯片的位置。

1.5.2 术后观察指标 分别于术后 1、7 d，1、3、6个月观察角膜是否透明、前房出血与术后并发症发生情况（如眼内出血、视网膜脱离、眼内炎症情况）。若眼屈光介质清晰则利用光学相干断层成像术（optical coherence tomography,OCT）（科林仪器股份有限公司），眼底照相（OPTOMED SMARTSCOPE VET2）及B超（法国光太AVISO眼科AB超）检查评估人工视网膜视觉假体电极芯片与视网膜的位置。

1.5.3 病理学观察 采用HE染色。植入术后6个月时，空气栓塞处死动物，摘取眼球后置于新鲜配制的10%甲醛固定2 d，将眼球从正中剪成两半，去除晶状体和玻璃体，小心取出视网膜钉，放入塑料包埋盒里，制作成石蜡块并在视网膜钉处进行切片，厚度为5 μm，将玻片放入烘箱（设为70℃）烤2 h，分别置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ液体各10 min，并用无水乙醇洗去二甲苯，洗去后将样本玻片依次浸入100%、95%、70%、30%乙醇各2 min，然后置于温水锅（37～38℃）煮2 min进行脱蜡。将玻片用蒸馏水润湿1 min，滤纸吸干水分，使用苏木素染色1～5 min，并用PBS冲洗，再使用1%盐酸乙醇和1%稀氨水返蓝后冲洗，并使用伊红复染，分别用95%乙醇、无水乙醇、二甲苯各处理2 min，吸取中性树胶液滴在组织上封片，在显微镜下观察视网膜形态学改变。

2 结果

2.1 人工视网膜视觉假体植入术中及术后情况 10只兔均完成人工视网膜视觉假体植入术。术中观察角膜透明。1只兔眼术中植入电极芯片时出现视网膜裂孔及视网膜出血，玻璃体积血较为明显；余9只兔眼无明显出血，人工视网膜固定于视网膜表面。人工视网膜视觉假体植入术中、植入术后1 d及1个月情况见图 4（插页）。

图4 人工视网膜视觉假体植入术中及术后情况（a：术中观察角膜透明，箭头示电极芯片；b：视觉假体植入术后1 d，角膜透明，前房气泡，少许出血；c：植入术后1个月时眼前节照相，箭头示人工视网膜视觉假体导线位于球结膜下）

2.2 人工视网膜视觉假体植入后安全性评估 10只兔进行植入手术后均完成了6个月的观察，无死亡情况。1只兔眼术中出现眼内出血，术后1个月时出血吸收，可见人工视网膜视假体芯片位正，芯片附近出现视网膜脱离；余9例兔眼术后无眼内出血，人工视网膜视觉假体位于视网膜表面，无视网膜脱离，见表1。

表1 人工视网膜视觉假体植入术后安全性评估[只（%）]

2.3 人工视网膜视觉假体贴附效果 因视网膜假体接收器位于兔背部，导线经皮下穿行，绕过颈部，因此术后兔头部活动度差，配合拍眼底照难度较大。眼底彩照显示视网膜表面人工视网膜视觉假体贴附，可见视网膜钉，见图5（插页）。B超检查显示视网膜表面扁平样物贴附，一端见高回声影突向玻璃体腔（符合视网膜钉声影），见图6。由于兔眼配合度差OCT扫描欠清，隐约可见视网膜表面有扁平物贴附，见图7（插页）。

图5 人工视网膜视觉假体植入术后眼底照相示意图（a：眼底照相拍摄兔眼的示意图；b：眼底照相中拍摄的人工视网膜视觉假体芯片，箭头所指为芯片位置；c：箭头所指为人工视网膜视觉假体的电极芯片；d：眼底彩照，箭头所指为视网膜钉所在位置）

图6 人工视网膜视觉假体植入术后B超检查示意图（a：B超检查示意图；b：后极部见高回声突起，箭头所示为人工视网膜视觉假体视网膜钉所在位置；c：人工视网膜视觉假体芯片所在位置）

图7 人工视网膜视觉假体植入光学相干断层成像术（OCT）检查示意图（a：术中OCT检查示意图；b：正常兔眼的视网膜OCT扫描结构，视网膜平复；c：视网膜表面见粗糙不均匀信号，为视觉假体芯片所在位置，未见视网膜脱离）

2.4 人工视网膜视觉假体植入眼内位置及病理切片评估 植入术后6个月时，摘除眼球，观察人工视网膜视觉假体芯片所在视网膜的位置，并进行病理切片检查，HE染色可见芯片植入附近视网膜外核层变薄，视网膜单核细胞浸润，见图8（插页）。

图8 人工视网膜视觉假体植入6个月时芯片位置及视网膜病理切片图[a：眼球摘除去除角膜后观察到眼底情况，箭头所指为视觉假体位置；b：切块眼球的纵向示意图，箭头所指为视网膜钉；c：病理切片示意图，可见外核层（ONL）和内核层（LNL）细胞排列紊乱，呈空泡样改变；RPE为视网膜色素上皮细胞；HE染色，×100]

3 讨论

国产人工视网膜视觉假体放置于视网膜表面，手术中操作空间大，术后6个月的观察结果显示，具有良好的视网膜贴附性，对视网膜损伤小，稳定性和安全性均较好，但是依然存在术中出血，形成视网膜裂孔的风险。

视网膜前视觉假体通过直接刺激神经节细胞产生信号，而在植入过程中常常通过钉子将电极固定于视网膜上，会损伤视网膜神经节细胞，同时植入视网膜钉时需要用力寻找突破感，力的大小难以把握，容易造成视网膜出血和视网膜脱离；因此通过视网膜钉把芯片成功植入视网膜上并减少损伤和并发症是该类技术的难点[9-11]。ArgusⅡ也是视网膜前的视觉假体，在2013年时获得FDA的批准用于临床实验。最新的一项57例在视网膜色素变性患者中使用人工视网膜视觉假体的临床研究表明，经过1年的观察，49%患者发生了不良事件，26%患者发生了严重不良事件，其中9例与产品有关，4例与手术操作有关，绝大多数不良事件均能解决，在该研究中也发现2例患者发生了视网膜脱离和玻璃体出血[12]。视网膜脱离及出血是常见的并发症，这一结论在5年的长期观察中也被证实，但概率仅为3.3%左右[13-14]。本研究也发现了1眼视网膜脱离，并有眼内出血，这可能与手术经验和钉子的材料有关。术中尽量控制眼压，是减少视网膜损伤的关键[12]。视觉假体植入前后需要密切关注并发症，并及时处理。

视网膜假体在体内的安全性和稳定性极为重要，本研究显示，国产人工视网膜视觉假体植入6个月时，视网膜结构发生了紊乱，主要表现为整个视网膜的萎缩，外核层的破坏和单核细胞浸润，提示植入体存在引起视网膜损伤的风险，然而神经节细胞的完整性是视觉假体发生功能的基础，因此未来的研究中应该更多关注如何减少植入体对视网膜的损伤[15-16]。视觉假体植入后可能发生炎症，在之前的临床研究中看到，绝大多数炎症发生在眼表，少有眼内炎的报道。本研究发现，植入体下方可以见到炎症细胞浸润的情况，玻璃体腔未见眼内炎，炎症也主要表现在前节[17-18]。表明该类型的人工视网膜视觉假体短期的观察安全性尚可，但仍需要延长时间观察视网膜结构的损伤恢复情况，力求通过设计优化，材质改进减少对视网膜的损伤。本实验为人工视网膜动物眼的初步安全性探索，同时在此基础上进行了有效性的初步检测，将体外发射线圈与皮下植入线圈耦合，发送电刺激检测电阻抗，显示植入体与体位设备连接正常，提示可正常工作。在此基础上，将在以后实验中结合视觉电生理诱发电信号分析其有效性。

综上所述，本实验表明国产人工视网膜视觉假体具有贴合性良好、损伤小、产品稳定等特点，具有广泛的应用前景。但植入中造成的视网膜损伤也是亟待解决的关键问题，需进一步扩大样本和延长观察事件，证实其安全性。本研究为国产人工视网膜视觉假体的动物眼植入实验早期探索，存在不足之处，因术后检查设备及术后兔颈部皮下导线的影响，对术后观察还不够详尽。之后将进行小型猪的国产人工视网膜视觉假体实验，希望之后的实验可以带来更多的成果，从而为其设计、技术改良及临床实验打下基础。