可视化荧光成像技术的胸部外科应用

鲍 峰，李子煜，元 及，吴宗阳

武警安徽省总队医院1胸外科，2医学影像科，安徽 合肥230001

胸部疾病中各类恶性肿瘤发病率高，其中肺癌、食管癌、胸腺癌等恶性肿瘤具有很高的致死率。在治疗过程中，外科医生常面临着如何准确定位良恶性组织，保证手术中肿瘤的安全阴性切缘，识别前哨淋巴结以期对肿瘤做出准确分期，以及如何预防处理吻合口瘘、乳糜漏等相关并发症等难题。可视化荧光成像（VFI）技术的不断发展向外科医生展示了这些术中细节，提高了手术安全性。以下就VFI技术在胸部外科中的应用进行综述。

1 临床前研究：荧光成像系统和染料

可视化荧光成像技术是基于近红外反射光谱的术中即时成像原理。需要近红外成像系统和荧光染料来实现，术中荧光团被近红外放射光谱投射到组织后激活，通过成像系统在白光和荧光模式间切换，捕获到的光学影像为外科手术提供所需要的解剖信息。目前临床常见的近红外反射光谱成像系统适用于开放和腔镜手术，图像分辨率和可视化模式略有不同。最常见的几种成像系统（表1）［1］。

表1 主流近红外成像系统Tab.1 Mainstream near infrared imaging system

美国食品和药物管理局和欧洲药品管理局批准用于临床的荧光染料是吲哚菁绿（ICG）和亚甲蓝。其中ICG的临床应用最为广泛。ICG是一种非靶向的近红外荧光剂，其激发和发射波长分别为805 nm和830 nm［3］，通过粘膜下、皮内、静脉等注射方式，ICG与脂蛋白或血浆蛋白结合，因其小直径流体分子特性而快速通过淋巴管、淋巴结、血管，其荧光图像指导医生识别肺结节，定位乳糜漏，标记前哨淋巴结，评估组织瓣吻合口血流灌注［4-5］，以及识别肿瘤切缘和肺段、肝段的段间平面，实现术中实时可视化。ICG在肝脏中代谢，相较于亚甲蓝，它的不良反应更小，而亚甲蓝仅在低剂量（＜2 mg/kg）时比较安全［6-7］。

2 胸外科临床应用

2.1 VFI应用于肺部小结节治疗

2.1.1 肺部小结节检出和识别 肺部小结节的检出率随着胸部低剂量CT的普及越来越高。在视频辅助胸腔镜手术（VATS）过程中，肺部小结节的准确定位识别是难点之一，因为腔镜下无法用手触诊的限制，一些术前（弹簧圈、定位针［8-9］、亚甲蓝+医用胶标记、碘油标记［10］）和术中（超声、电磁导航支气管镜引导技术［11］）等手段被应用，但存在对设备的额外需求，标记不准确，染料污染扩散，有创，电离辐射等问题。VFI 技术中的荧光剂在肿瘤组织内可选择性积累，从而被成像系统识别，无电离辐射，学习曲线短。由于ICG 的安全性，一项高剂量（5 mg/kg）输注ICG，并与低剂量VFI灌注区区别开来的技术近年来被提出来，并有特定的术语Tumor Glow®，又称“第二窗口”技术［12-13］。机制是小分子的ICG在循环中约98%与蛋白质结合成大分子［14］，通过加强肿瘤的渗透性和滞留效应，这部分大分子被保留在肿瘤组织内［15］，以达到识别肺结节位置和判断肿瘤残留情况的目的。有学者使用Tumor Glow®技术在9例肺肿瘤患者中发现了8例荧光显像，未发现2例新辅助化疗后患者的肿瘤残留［16］。有学者运用“第二窗口”技术ICG成像识别出36个患者76个肺结节中的68枚，可见ICG的近红外成像对亚厘米肺结节的检出优势［17］。ICG的劣势是其特异性和穿透性不足，既往有研究中未检出的肺结节距离胸膜至少1.3 cm处［17］，而且荧光区域易受到肿瘤周边炎症的干扰。在一项动物实验中，荧光界限受到肺炎病灶的影响，对肿瘤的边界产生了误差［18］。正是基于改善特异性和穿透性的缺陷，有别于ICG的靶向分子显像剂被开发出来并用于临床研究。

叶酸受体是肺腺癌的高表达分子靶点，而EC17就是基于叶酸受体的光学造影剂［19］。EC17表现出的高特异性和敏感度，在诊断肺腺癌方面，快速准确的特点甚至优于冰冻切片。既往有研究［20］证实了这点，其利用EC17的“光学活检”手段，检测30个未知性质肺结节，检出19个荧光结节，术中冰冻示13例腺癌，1例鳞癌，4例来源不明，1例良性结节，根据快速病理18例行肺叶切除术，1例楔形切除。但术后病理却提示19例全部为肺腺癌，而11例未发光的结节经术后病理证实为良性肿瘤或其他来源肺癌，无一例腺癌。这意味着EC17诊断肺腺癌有高度特异性和敏感度，也表明依赖术中切片可能带来的治疗策略的错误，因此对VFI中显影的荧光结节全部切除或许是一种更稳妥的做法，且大大节约了诊断时间（平均2.4 minvs26.5 min）。OTL38则是另一种靶向近红外染剂，与EC17相比穿透深度更好，对亚厘米恶性肺结节的敏感度为100%，优于FDG-PET 的26.6%［21］。OTL38可识别约70%的肺鳞状细胞癌［22］。

2.1.2 胸腔镜亚肺叶切除中段间平面识别 肺部磨玻璃结节的检出率越来越高，大多是肺原位腺癌或微浸润腺癌，这部分患者行胸腔镜亚肺叶切除术都能获得良好的预后［23］。而准确辨认段间平面是此类手术的关键。目前临床常用的方法包括“膨胀-萎陷法”和“ICG染色法”，前者利用的是通气差异原理形成段间平面。由Tusbota［24］在2000 年首次提出，后经多次尝试和改良，2003 年、2007年实现了靶段支气管纤支镜下充气［25-26］，2007年有研究报道输液针在靶段支气管穿刺充气［27］，以及2014年报道的活结结扎支气管［28］，充气后收紧使靶段充气等，这些方法存在充气状态下肺组织影响视野，需额外小切口辅助，对纤支镜不同直径的要求，需要有经验麻醉师的配合，空气栓塞等安全性隐患。2017年有学者完成了改良“膨胀-萎陷法”，在全部处理完毕靶段支气管、动脉、段内静脉后用纯氧通气，等待12～15 min后形成段间平面［29］。这也是现今在很多医疗机构普及的方法，无需额外设备和染料，但需要熟悉解剖，误断可导致段间平面的显示错误。

“ICG染色法”利用的是循环差异原理。在离断靶段动脉后由外周静脉注射ICG（3 mg/kg），这种预切除肺段血管反向染色方法在临床也取得较好效果。该方法在2009年应用于肺段手术中［30］，对肺气肿患者友好，成像快速清晰，不足是需要购买价格不菲的近红外成像设备，平面维持时间较短，部分患者对染剂过敏。ICG还被用于局部注射，麻醉师通过纤支镜向靶段支气管中注入ICG溶液（3 mg/mL，20～30 mL），后充入约300 mL的气体稀释。有学者认为这种方法在肺亚段和联合亚段切除中有优势［31］；2013年有研究对其进行创新［32］，在结扎段间静脉和支气管后，向支气管远端利用输液针直接注入ICG溶液（0.5 mg/mL，50 mL），并在直视下观察段间平面，不需依赖成像设备。后期还出现用亚甲蓝染剂，向保留段支气管中注入后的正染色法。但是支气管注入染剂显影时，不同肺段的容积不同，选择合适的剂量及稀释气体容积，才能获得准确的界面，初步研究［33］结果显示，均匀荧光分布显示目标肺段的最佳截断体积比例为：0.089 mL稀释的ICG每单位体积（mL）靶段肺（敏感度0.938，特异性1.0），可通过相关3D图像分析软件测算体积。“染色法”相较“膨胀-萎陷法”而言，显示段间平面更加准确快速，但都要依赖对解剖结构的精准辨认，同时熟悉掌握术前三维重建规划手术对胸腔镜亚肺叶切除术显得尤为重要。

2.2 识别肿瘤切缘和残留

胸部恶性肿瘤手术的关键是R0切除，无肿瘤残留，保证切缘阴性［34］。外科医生常凭借视觉和触诊做出判断，并过于依赖经验，这很容易造成切缘假阴性误差，而VATS术式也限制了这种诊断方式。此外还有冰冻切片、细胞学灌洗以及术中超声等方法，但其较繁琐，并可能带来一定程度上的误差。针对肺腺癌，有学者建立了一组小鼠模型，并纳入3个肺腺癌患者进行了初步研究，比较人工检测切缘与荧光剂（EC17）的术中分子成像方法，结果显示在小鼠模型中，荧光法较人工判断有更高的阳性切缘检出率［35］。在肺腺癌患者中，术野无残留无荧光，术后1年肿瘤未见复发。少量的自体荧光区域也未对肿瘤本身和切缘造成影响。在胸腔镜亚肺叶切除术中，分子成像可作为判断切缘的有效辅助手段，在肺叶甚至全肺切除术中同样可以发挥作用，有助于提高对浸润邻近结构的肺叶、胸壁的残留病变的检出率，从而达到R0切除［19］。在胸腺癌、恶性胸膜间皮瘤等一些其他胸部恶性肿瘤治疗中，VFI改善了手术可视化［36］，帮助提高肿瘤的完整剥离，避开膈神经等重要结构，在一些巨大的良性前纵隔肿瘤切除中亦有意义。恶性胸膜间皮瘤的高致死率提示着不良预后，手术中肉眼不可见的间皮瘤沉积物是否能被完整切除至关重要。一项实验通过近红外成像发现了肉眼无法察觉的额外沉积物，平均每位患者会漏诊1.8个，大小0.3～2.2 cm［37］。因此，在胸部恶性肿瘤手术中应用VFI识别切缘和残留病灶可起到更准确分期，避免中转开放手术，以及可能减少术后辅助治疗的作用。

2.3 防治胸部手术并发症

2.3.1 评估灌注预防吻合口瘘 关于在食管癌手术中应用ICG预防吻合口瘘的预测价值，既往研究和meta分析已证实其有效性。吻合口瘘是食管癌切除术的一个致死并发症［38］。虽然影响因素众多，但管状胃的血供常仅靠胃网膜右动脉提供，吻合位置高及血供不佳才是吻合口瘘的常见危险因素［39］。以往外科医生依赖的是对吻合区血管搏动，组织灌注颜色、温度、吻合区域出血等视触觉观察方法，但事实证明，人工风险评估预测价值较低［40］。而当ICG被引入到吻合前对灌注区的观察后，术者可以直观地了解预吻合区域的血供，并由此可能做出吻合策略改变，并影响到术后吻合口瘘的发生概率。一项meta分析显示，吻合前应用ICG对管状胃灌注评估，可将吻合口瘘和移植物坏死发生率降低70%（OR=0.30，95%CI：0.14%～0.63%），安全且无不良反应［41］。纳入22篇ICG评估灌注的文献，荟萃了22项研究，统计出ICG 组并发症合并发生率11.1%（95%CI：8.06%～15.09%），有8项研究报道了因预吻合区灌注不良导致管理策略变化（改变吻合区域，切除无血供区）的病例，变化后吻合口瘘和移植物坏死合并发生率14.08%（95%CI：6.55%～27.7%）。这种管理策略的改变体现的是ICG荧光造影的附加价值，而“管理变更”后相对高的渗漏率可理解为术者选择在灌注良好区吻合，但以高吻合口张力为代价。有研究发现在ICG荧光造影时，从静脉注射荧光剂到显影中位时间为15 s（10～23 s），管状胃和网膜血管同步显影无延迟病例，术后无吻合口瘘发生［42］，可见ICG荧光测量血流速度可作为一项预测风险的工具，任何有延迟显影的血管区可能意味着有一定程度的损伤。关于吻合时间，有学者利用时间荧光强度曲线对荧光信号的定量分析，提出了“90 s原则”，即在90 s初次荧光强化时限内吻合很重要［43］。虽然在食管癌手术中应用ICG预防吻合口瘘的预测价值似乎是一项有前景的方案，但仍需要更多的研究来验证可行性和安全性，以降低目前偏高的并发症发生率。

2.3.2 识别胸导管和乳糜漏 VFI荧光成像也被应用于淋巴管造影中，来治疗相关疾病。食管癌切除术后乳糜漏发生率为1.4%～2.4%［44］，肺切除术及纵隔淋巴结清扫术后为1%～2%［45］。在术中识别胸导管减少医源性损伤，以及二次手术治疗乳糜漏时常用的方法是术前口服浓奶油、橄榄油等［46］，漏口显露不清时常选择低位胸导管大块结扎，效果并不确切。相关临床报道中，在超声引导下将ICG注射到腹股沟淋巴结，术中通过荧光成像来识别胸导管或修补乳糜漏口的方法安全有效，还避免了预防性结扎胸导管的步骤，操作简便，不额外增加手术时间，也可以给术者提供明确的视觉反馈，对胸导管走行和漏口提供实时可视化图像，具有理想的特异性和敏感度［47-48］。但具体的注射部位和剂量浓度仍需有更多的对比研究来逐步标准化。

2.4 识别前哨淋巴结

恶性肿瘤淋巴池内的第一个淋巴结往往可代表其剩余区域内淋巴结的状态，即为前哨淋巴结。在肺癌、食管癌手术中识别前哨淋巴结有助于肿瘤的准确分期，以指导后续治疗和影响预后［49］。既往在非小细胞肺癌应用99mTc硫溶胶示踪剂［50］来识别前哨淋巴结的效果低于预期。有学者完成了一项剂量递增试验，在非小细胞肺癌患者瘤周注射ICG，剂量增至2500µg时可将前哨淋巴结识别率提高至100%，且无不良反应［51］。这验证了这一技术的可行性和安全性。有研究在食管癌切除术中的肿瘤瘤周粘膜下注射ICG，观察到95%（19/20）病例中阳性的前哨淋巴结［52］。有研究在10例食管癌（其中9 例为腺癌）患者中应用该方法，5 例单纯注射ICG，5例ICG混合人血清白蛋白（ICG：HSA）后进行淋巴绘图，结果提示淋巴状态与前哨淋巴结状态密切相关［53］。2016年有学者将9例食管癌患者纳入研究，其中3例的34个淋巴结转移，经ICG显像的第一站前哨淋巴结都为转移，并且8例（88.9%）荧光成像提示首站淋巴结引流都在胃左动脉淋巴结（17站），1例（11.1%）在横膈膜淋巴结（15站）处［54］。在美国，二野淋巴结清扫［55］的术式在临床被推荐；而在日本，三野淋巴结清扫［56］成为常规术式。对前哨淋巴结的研究可能会对食管癌切除术的策略产生影响，例如可否避免更大范围的淋巴结切除，或早期食管癌的食管保留策略等。当然这需要更大样本量的临床试验来检验。

3 展望

VFI技术在胸部外科中的应用日渐成熟。同样利用循环差异原理，荧光成像用于辨认肺隔离症中受损肺的边界理论上是可行的，尤其是“叶内型”隔离肺，因为该病并不常见，相关报道不多。有学者结合术前三维CT血管造影和术中ICG染色，在3例肺隔离症患者手术中，安全准确地切除了受损肺组织［57］。目前在临床应用最多的领域是在胸腔镜亚肺叶切除手术中段间平面的识别。广东省肺癌研究所钟文昭团队提出的“流域外反染法”定位无法触及的肺结节，给胸外科医生提供了新的思路［58］。通过暂时阻断目标靶段肺动脉循环，结合ICG染色，使用术前高精度三维重建模型和术中“流域边界”对照，精准判断出结节位置。研究所选择的病例肺结节与“流域边界”有着明确的位置关系，所有25例患者都行楔形切除术，但这种方法需要很高的三维重建建模技术。分子成像技术代表了胸部外科的新前沿，在不久的将来，期待更多的靶向染料被开发出来，以克服目前临床使用的ICG特异性和穿透性不足的缺陷，还有成像设备的更新迭代。设想可为患者提供可识别不同组织类型肿瘤的示踪剂，可利用精确的“光学活检”技术来替代现有的冰冻切片，以评估术中实时的肿瘤切缘性质。当前，需要更多的前瞻性研究来确定VFI技术对胸部肿瘤预后的影响。随着技术的发展，我们可预见VFI会被越来越多的医疗机构纳入临床实践，也会将其逐步标准化和精细化。