传统酱油发酵制曲菌种中的酶活分析及制曲工艺优化

吴教培

（广东珠江桥生物科技股份有限公司，广东 中山 528415）

1 制曲菌种的主要类型及特点分析

1.1 米曲霉

米曲霉（见图1）生长速度快，菌落在不同阶段的色泽表现不同，初期以白色、黄色为主，成熟后呈现出黄绿色和淡绿褐色。温度对米曲霉生长状况的影响较为显著，最佳温度为30℃，低于28℃时菌体虽然增长但趋于缓慢，超过37℃时菌体代谢活动受到抑制，与此同时酶活也随之降低。酸碱条件方面，pH 为6.0 时适宜米曲霉的生长。米曲霉属于好氧微生物，因此通入足量氧气是促进其生长的关键。在酱油酿造中，为保证食品的品质，需选择优质的米曲霉菌种，其应当具备如下特点：①以蛋白酶为代表的酶系酶活高，此条件下可促进原料的分解。②代谢产物“无害化”，即不存在黄曲霉素或是其他的有害物质。③原料生长效率高。④基于米曲霉酿造的酱油有足够的豉香味，整体品质稳定。

图1 米曲霉实物（图片来源：网络）

在米曲霉菌株中，编号为沪酿3.042 的菌株主要特点是因为其生长速度快、酶蛋白活性高、适用范围广等，但也有局限之处——它的淀粉酶和酸性蛋白酶活力有限，发酵时的相应的酶解能力偏弱，导致产品的品质略微受到影响，例如酱油的风味较为单薄。针对该菌株的应用局限性，有关技术人员在原有基础上加以诱变和改良，得到更具可行性的菌株。较之原菌株，经过紫外诱变的手段得到的突变菌的遗传稳定性更可靠。

产蛋白性能提升；而通过紫外线和LiCl 复合诱变技术的应用，蛋白酶活力显著增强，在酱油酿造中的优势随之凸显，氨基酸态氮和全氮的含量均有提高。

1.2 黑曲霉

黑曲霉的主要适宜生长条件为：温度37℃，pH5.6～6.0。得益于产糖化酶、淀粉酶能力较强的优势，酱油制造中常常用黑曲霉，在发酵时掺入适量后，可以分泌丰富的酸性蛋白酶，在该产物的促进作用下，蛋白质利用率得以提高，且该变化在发酵中后期体现得更为明显，随之带来氨基酸液态生成率提升的变化。依托于糖化酶、淀粉酶的共同作用，美拉得反应效率高，产生的基底物质在改善酱油品质方面效果良好，具体有：①促进增香酵母的生长，使酱油具有更浓郁的香气。②加快风味物质的产生。不仅于此，黑曲霉分泌的其酶也依然具有利用价值，在改善酱油的风味方面有积极作用。

1.3 红曲霉

温度最高35℃最低32℃，pH 在4.5 左右的环境条件适宜红曲霉生长，并且它对于发酵底物的选择很宽泛，能够有效地应用多种形式的氮源和碳源。红曲霉对环境的抵抗性较好，在酸性、高温环境中可维持相对稳定的状态，糖化增香曲是红曲霉的重要产物。此外红曲霉的酯化和糖化能力都很强，而糖化增香曲更是为酿造提供了优质的原材料。通过糖化增香曲的应用，酱油中氨基酸态氮和总氮的含量均有增加的变化，酱油的综合品质得到提升，具体体现在色泽、香味、口感等多个方面，酿造出的酱油更加受到消费者的青睐。

1.4 酱油曲霉

酱油曲霉与米曲霉相似，两者的区别主要体现在酶的种类和活力两个层面。在对碱性蛋白酶为参数标准进行对比中，酱油曲霉的活力更强，并且其与大豆蛋白接触后将高效促进蛋白水解进程。虽然酱油曲霉在酿造领域具有优势，但应用范围相对较窄，主要在日本酱油酿造中取得应用，而绝大部分的酱油酿造普遍采用的是米曲霉等菌种。

2 试验菌种与方法

2.1 菌种的选择

将曲霉菌中进行编号，得出表1。

表1 酱油制曲中需要用到的菌种

为制备曲霉菌斜面，2%琼脂，5B1 麦芽汁斜面共同作为培养基，在该原始装置的基础上接种一环原种，随后予以7～10d 的培养。

2.2 酱油种曲的制备方法

按照豆粕:麦麸:水=20:80:110 的比例选用适量的原材料，构成混合物，向500mL 三角瓶中加入15g（要求选用的混合物有足够的均匀性），予以40min 的灭菌处理，全过程中温度均保持在121℃。按前述方法操作后，待其达到冷却状态时，接种两环霉菌斜面孢子，再转至30℃的恒温环境中，持续72h 的培养。

2.3 菌种酶活力的表达

分多种情况考虑：以微克计算数据代表的酶活性单位u 的酶类型有：中性蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶；毫克计算数据表示的有糖化酶、谷氨酰胺酶；而以毫升计算数据来表示的只有淀粉酶。

3 试验结果分析

（1）多项参数均在酱油呈固态发酵时发生变化，主要有物料、微生物群种、水量、温度和pH。在发酵时，前期有温度波动的情况，受温度的影响，霉菌的细胞活动能力减弱，甚至几乎达到停滞的状态；酱油酿造的关键是综合酶系，其主要源自于两种途径：①由种曲带来。②在前期菌种生长期间产生。各类酶的最适pH 存在差异，在pH 降低的变化条件下，蛋白酶的酸碱环境发生改变，先从碱性转至中性，再进一步转至酸性，继而进入到适应于该蛋白酶的最佳区间，其中表现较为显著的为酸性蛋白酶，该部分可大幅度提高蛋白酶的利用率。从总蛋白酶活力的角度来看，黄曲霉2246 和米曲霉2339 在此方面的特性均较为突出，即总蛋白酶具有较强的活力。

（2）淀粉酶在酱油酿造中扮演着“转化者”的角色，在与原料接触后可对其中的淀粉加以分解，得到单糖，该类物质可被微生物利用，此时产生2 个方面的促进作用：①酵母和乳酸菌的生长更为旺盛。②酱油的还原糖含量增加，会产生酱油香味物质的前体。不同曲霉菌种的糖化酶活力存在差异，其中米曲霉2174 最高；从淀粉酶活力的角度来看，则以米曲霉2119 最为突出，可以说明的是，此类曲霉菌种的淀粉液化能力优于试验中的其他菌种。

（3）谷氨酸是决定酱油鲜味程度的关键物质，但需注意的是，对于酱油植物原料而言有明显的特殊性，并非所有的谷氨酸均以呈味的谷氨酰胺形式存在，因此谷氨酸的提鲜功能受到抑制。从这一角度来看，若要改善酱油的风味，需要将谷氨酰胺酶活力的提升作为重点的突破口，选择的曲种在此方面应具有突出的能力。在本次分析的曲霉菌种中，各自的谷氨酰胺酶活力有所差异，其中以黄曲霉2062 和2246 两类最为突出。

4 讨论

（1）酸性蛋白酶与中性蛋白酶无明显的关联，就酶活力而言，酸性蛋白酶相对较弱，究其原因，可能与制曲条件偏中性有关，此环境下会对酶的表达产生抑制作用。高酸性蛋白酶活力酱油制曲菌种的选择和培育将是未来研究的关键，得到酿造性能更为优越的优质菌种，将其作为酱油酿造时的原料，以保证酱油产品在色泽、口感等方面均更具优势。

（2）研究内容的发展离不开对于酶活力的探讨和工艺的进一步提升，取没有拮抗的米曲霉2174 和2339，予以混合，产生的种曲的各类酶活力无明显的“短板”，可以达到相对均衡的状态；再将其投入至低盐固态发酵试验中，实际应用效果良好，酿造酱油的品质较高。