酯酶的应用及研究进展

石 馨,惠 明,田 青,黄继红

(河南工业大学 生物工程学院,河南 郑州 450001)

随着社会经济的飞速发展,人们对生活质量的要求日益提高,消费者越来越追求天然的产品。在食品工业中,利用生物手段生产风味物质或改善食品原料风味将是未来发展的主流趋势。酯酶,即通常意义上的羧酸酯酶,能够催化酯键合成和水解,是一类极具潜力的酶。酯酶催化酯合成时,催化酸的羧基和醇的羟基脱水缩合生成酯类和其他风味物质;酯酶催化水解时,催化酯键产生醇类和脂肪酸类物质[1]。酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中,可以作为生物催化剂用于制药工业、化学工业、食品工业和乳制品工业等领域[2-3],其中一些酯酶还有助于食品风味的产生,尤其对白酒有增香作用[4]。

1 酯酶的种类

根据酶学国际生物化学和分子生物学协会的规定,酯酶属于水解酶的亚组1(EC3.1),按照水解酯键的不同类型再进一步分为亚型(EC3.1.1.1)。通常意义上的羧酸酯酶,主要指水解羧基类酯,共有20种(从EC3.1.1.1到EC3.1.1.20)。根据酯酶的底物特异性不同[5],可将其分为非特异酯酶和特异性酯酶。非特异性酶如羧酸酯水解酶,以脂肪族和芳香族醇为底物,可以作用于乙酸乙酯、丁酸乙酯、甘油三丁酸酯和乙酸苯酯等,特异性酯酶又可分为醇特异性和酸特异性。醇通常是一元醇或多元醇、脂肪族醇或芳香族醇,酸通常是有机酸或无机酸。酯酶和脂肪酶虽然都是可以作用于酯键的酶,但二者最主要的区别就是底物特异性不同,酯酶倾向于水解短链底物(碳原子数<10),脂肪酶则主要作用于长链底物(碳原子数>10)。根据来源不同[6-7],可将酯酶分为动物源酯酶、植物源酯酶和微生物酯酶,因微生物具有易培养、周期短和不易受环境气候的影响等优势,所以关于微生物酯酶的研究相对较多[8]。自然界中能产生酯酶的微生物资源十分丰富,从分类上看主要有真菌、细菌以及个别放线菌,主要菌种如表1所示。

表1 部分产酯酶菌种

2 酯化作用中酯酶的催化特性

2.1 反应介质的影响

根据目前的研究结果,非极性有机溶剂更适合酯酶的酯化反应[9],溶剂的存在会使反应平衡转向酯生成的方向,尽可能地使酯完全转移到有机相中[10]。疏水性溶剂作为酶反应介质通常优于亲水性溶剂,因为后者更容易从酶分子中剥离紧密结合的水,这也是影响催化活性至关重要的因素。同时,由于疏水性溶剂对酶基本呈惰性以及酶在脱水状态下的构象呈刚性,不会导致水溶液中的酶发生不可逆失活的普遍共价反应,因此酶在无水有机溶剂中具有可预测的极端耐热性[11]。

2.2 酶的用量和反应条件的影响

在反应体系中,酶的用量并非越多越好。如果反应体系中酶量很少,底物质量浓度足够高,增加用酶量会使反应速度加快;如果酶足够多,再增加用酶量,不仅不会提高催化反应速度,而且会产生一些弊端。比如过高的酶量会使溶液黏度增加,妨碍底物扩散,从而降低酯化反应速度;在有机相中,酶量过多,会导致进入酶的活性部位的底物缺乏,并且在较高的酶质量浓度下生物催化剂的均匀性难以保持,因此产量不会显著增加[12]。酯酶的最适反应条件与反应介质有关,在有机相和水相中不同。有机相中,酶的热稳定性有所提高,所以酯酶催化温度一般比在水相中高一些。

3 酯酶结构及催化机理

目前酯酶蛋白的结构已经得到初步阐明,属于α/β水解酶家族,其折叠示意如图1所示。由于其结构特殊,使其具有了许多生物学功能,比如水解、病原体防御和能量代谢等。大多数的酯酶在三维结构中都具有特征性的α/β水解酶折叠,即α螺旋和β折叠。尽管其序列具有多样性,但以丝氨酸(Ser)为活性位点、以组氨酸、谷氨酸或是天冬氨酸组成(Ser-His-Asp/Glu)的催化三联体和五肽结构(Gly-X-Ser-X-Gly)在大多数情况下是保守稳定的[13],主要是因为α/β水解酶的折叠结构为脂肪酶的活性位点提供了一个稳定的支架[14-15]。在蛋白质二级水平上,不同微生物脂肪酶的结构差异主要体现在α螺旋和β折叠的数量、α螺旋的空间分布和β折叠扭曲角度的差异[16]。

图1 α/β水解酶折叠示意图Fig.1 Schematic presentation of the α/β-hydrolase fold

酯酶的水解通过2步完成:首先形成一个酰基化的酶中间体,通过一个质子从丝氨酸转移到组氨酸,从而使丝氨酸羟基变得更具亲核性,组氨酸和谷氨酸或是天冬氨酸之间形成氢键而变得稳定,由底物与具有活性的丝氨酸结合,生成一个稳定的四面体中间体,随后此中间体解体形成酰基酶复合物,此过程中释放丝氨酸和底物中的乙醇;然后被水分子激活组氨酸攻击酰基复合物,重复第一步并释放底物中酸的部分,被保留下的丝氨酸残基为谷氨酸的空间位置的确定提高结构支持,从而稳定了该催化三联体。脂肪酶和酯酶虽然都作用于酯键,但二者的区别在于界面活化现象,结构分析表明这种界面活化是因为一个疏水结构域覆盖了脂肪酶的活性部位,而酯酶不存在这种现象,酯酶往往优先水解简单酯,如乙酸乙酯,通常只水解短于六碳的脂肪酸的甘油三酯[17-19]。

4 酯酶在风味合成中的应用

风味的形成是一个生化过程,无论是通过正常新陈代谢积累的风味物质,还是通过细胞破坏产生的风味,都要有2个先决条件:1) 形成风味物质的底物;2) 催化风味物质形成过程中的酶系。短链脂肪酸酯由于其典型的果味气味和高挥发性而被广泛用于食品、饮料、化妆品和制药工业中[20-21]。目前,生物酶法是合成风味的一种新方法,通过生物合成生成的产物为天然产物,更容易被大众接受,这种方法被认为是有望成为工业化生产的一条途径[22]。而目前大多数的风味化合物都是由化学合成或从天然资源中提取得到,天然提取的香料酯提取量较少,因此应用于工业用途上往往过于昂贵。商业上使用的低分子酯通常是直接通过酸醇酯化生成,现已生成多种脂肪族和芳香族的香味酯,如乙酸乙酯、丁酸异戊和月桂酸丁酯。

1972年,美国学者利用酯酶给黄油增香,将黄油乳化后加酯酶保温催化,此时黄油可以释放脂肪酸,获得的酯化液香气是未酯化时的150倍[23]。短链特异性酯酶和广谱脂肪酶可以使乳脂产生各种风味物质。各种脂肪酶系统的范围和可能的组合尚未被充分探索,脂肪分解技术的未来进展极大可能发生于更广泛的脂肪基质。酯酶技术中的2个主要变量底物组成和酶的特异性可以相互作用,增加潜在的风味特征[24]。比如,酯酶活性对乳酪中香气物质的释放起着至关重要的作用,乳酪香气主要取决于脂肪酶的活性,将甘油三酯分解为甘油和脂肪酸。游离脂肪酸是脂肪分解的主要产物,可以对奶酪质地产生影响,有助于直接和间接地表征许多奶酪的风味,这些物质通常也是许多合成芳香族化合物的前体物质[25]。宋云花[26]筛选出一株高产丁酸乙酯的乳酸菌,该菌所产酯酶可以促进干酪成熟过程中的三丁酸甘油酯和乙醇形成丁酸乙酯,显著增强干酪的水果风味。

5 酯酶对白酒产酯的影响

近年来,不少学者利用酯酶技术来提高白酒中风味物质的质量分数,效果十分显著,在酒厂中也得以使用。在白酒的生产中,酯类物质是区分白酒香型的重要因素,是白酒香气的主体香味成分。酯类是浓香型白酒中质量分数最高的芳香物质,约占60%。其中,己酸乙酯是构成浓香型主体香的主要物质,尤其突出己酸乙酯的气味特征[27]。浓香型白酒在窖泥地窖发酵过程中获得了独特的风味,窖泥中的微生物通过代谢活动产生的小分子物质是这些风味形成的关键前体[28],不同的微生物群落也会影响风味物质的形成。

通过醇酸之间的酯化反应得到白酒中的酯类物质,主要有2种方式:

1) 由发酵过程中的微生物产生次级代谢产物形成。比如酵母菌中酯类形成途径中主要有乙醇或高级醇、脂肪酸、辅酶A和酰基转移酶等物质参与[29-30]。在此过程中,脂肪酸和辅酶A结合而被活化,形成相应的酰基辅酶A才能和乙醇合成相应的乙酯,醇和酰基辅酶A再在醇酰基转移酶的作用下生物催化形成相应的酯,在白酒发酵过程中,酵母菌作为完整的发酵微生物不仅起着主导利用,而且对酒体风格及品质起着至关重要的作用[31],酵母代谢产酯的途径为

2) 通过游离的酸醇分子在酶类物质的催化下发生反应。白酒发酵过程中添加的酒曲,利用酒曲中酯酶的作用催化而生成相应的酯类[32]。液体发酵时,酯酶可以水解水相中的脂肪,可将酒醅中的脂肪水解成甘油和脂肪酸,脂肪酸与乙醇酯化生成油酸乙酯、亚油酸乙酯等高级脂肪酸。固态发酵条件下,酯酶催化己酸、乳酸和丁酸等小分子酸与乙醇作用,生成相应的己酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等风味物质。大曲在白酒发酵过程中提供了重要的微生物来源[33],是影响白酒的质量和风格的关键因素[34-35]。

白酒风味的形成受多种因素影响,比如:发酵培养基的组成可影响酯的生成量;发酵谷物中存在的微生物及其分泌的酶对酯的合成也产生影响。在发酵过程中,发酵谷物中微生物产生的酶将蛋白质、碳水化合物和脂肪等高分子量物质分别分解为氨基酸、低聚糖和脂肪酸等低分子量物质。微生物利用小分子作为营养物质,为风味物质提供丰富的前体物质。酶的活性不仅影响发酵粮中各种物质的转化,而且直接影响风味物质的种类和数量,对白酒的品质有很大影响。例如,在发酵过程中,酯酶直接催化乙酸和丙酸与乙醇的酯化反应,合成乙酸乙酯和丙酸乙酯[36]。根据吴华昌等[37]的研究,提高发酵粮中脂肪酶活性,可提高酒中总酯质量分数,在发酵粮中添加纤维素酶可以提高酯的质量分数,尤其是乙酸乙酯。由于自然环境的差异,不同地区的白酒风味存在明显差异,不同微生物的特殊作用会影响发酵谷物中的酶系组成,从而影响酯的形成[38],同时酶活性和前体物质的质量浓度也是影响酯生产的2个关键因素[39]。

6 结 论

与其他国家相比,我国对酯酶的研究和开发起步较晚,可用于商业化的酯酶种类较少,产酯酶菌株的分离纯化难度大,生产效率低。随着基因工程、宏基因组文库的建立与发展,对于酯酶的研究应逐步偏向分子层面,比如酯酶分子的纯化及高效工程菌株的构建。研究发现:部分酯酶存在特殊性,需要进一步的研究和开发,从而使酯酶的应用范围得到进一步的拓展。因此,筛选产酯酶菌株并将其应用于食品工业,达到提高产品感官品质和经济价值的目的,以及应用到酿酒工业中来改善白酒的品质仍然具有广泛的发展前景。