毛木耳野生菌株Aa-019的鉴定与菌丝生长条件优化*

杨 杰，郭 尚，刘 虹，车星星，骈跃斌

（山西省农业科学院食用菌研究所，山西 太原 030031）

木耳属（Auricularia）真菌是我国分布较广的木腐真菌，人们常见且较熟悉的物种有黑木耳（Auricularia auricula） 和毛木耳 （Auricularia cornea）[1]，该属中多数种不但味美质脆、营养丰富，且在民间也常用作药材使用[2-3]。开展野生木耳菌株的搜集、鉴定以及生物学特性研究工作，不仅可为进一步了解我国木耳属真菌的系统发育情况提供参考，还可为黑木耳、毛木耳等可栽培木耳属真菌的品种选育提供种质材料[4]。

山西拥有丰富的野生木耳属种质资源，除黑Aa-015等少数品种被利用外[5-6]，其他有关山西木耳属菌株搜集、驯化等方面的报道较少。通过鉴定山西太原地区所搜集木耳属野生菌株Aa-019并优化其菌丝生长条件，旨在为该菌株的稳定性栽培和商业化选育提供必要参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

菌株Aa-019，原采自山西省太原市，由山西省农业科学院食用菌研究所分离、复壮和保存。

1.2 供试配方

子实体分离配方：PDA培养基46.0 g·L-1、蛋白胨 2.5 g·L-1、KH2PO41.0 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1[1]。

适宜碳源试验配方：供试碳源分别为葡萄糖、乳糖、蔗糖和甘露醇，浓度梯度设置均为10 g·L-1、20 g·L-1和 30 g·L-1，其他添加物质为蛋白胨 3.0 g·L-1、KH2PO41.00 g·L-1、MgSO40.45 g·L-1和琼脂 12.0 g·L-1[1]。

适宜氮源试验配方：供试氮源分别为蛋白胨（浓度梯度为1.0 g·L-1、3.0 g·L-1、5.0 g·L-1）、酵母浸出粉（浓度梯度为2.0 g·L-1、4.0 g·L-1、6.0 g·L-1）、尿素（浓度梯度为1.0 g·L-1、2.0 g·L-1、3.0 g·L-1）和 （NH4）2SO4（浓度梯度为 1.0 g·L-1、2.0 g·L-1和3.0 g·L-1），其他添加物质还有葡萄糖20.0 g·L-1、KH2PO42.0 g·L-1、MgSO40.45 g·L-1和琼脂 15.0 g·L-1[1]。

适宜pH筛选配方：以PDA为基础配方，在倒平板前于超净工作台上用1.0 mol·L-1的NaOH溶液和 1.0 mol·L-1HCl溶液配成 pH分别为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的供试培养基[1]。

适宜温度筛选配方为PDA配方。

1.3 菌株Aa-019的ITS鉴定

将供试菌株Aa-019接种于PDA培养皿上于26℃培养7 d，进行菌株活化。将活化后的菌株Aa-019交于山西修同生物科技有限公司，委托其采用快速抽提试剂盒进行DNA提取，ITS-PCR扩增、测序和检索，并用Neighbor Joining法构建遗传发育树。

1.4 菌丝生长条件优化试验

1.4.1 碳源、氮源和pH优化试验

选取活化后大小和生长一致的供试菌种块接种于供试碳源、氮源和pH培养基中，于25℃暗培养，待菌落长至培养皿2/3时，采用游标卡尺十字交叉法测定菌落直径，计算菌丝生长速度，记录菌丝长势。每个处理设3个重复。

1.4.2 适宜生长温度筛选试验

将供试菌株接种于PDA培养基中，分别置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和 35℃条件下暗培养，每个处理设3个重复。菌丝生长情况测定参见1.4.1。

1.5 数据处理

试验数据统计及分析采用WPS和SAS 8.1完成，涉及多重比较的采用Duncan新复极差法[7]。

2 结果与分析

2.1 菌株Aa-019的鉴定结果

野生菌株Aa-019的形态特征见图1。

通过图1形态观察，该菌株子实体无柄，胶质，呈杯状，有明显髓层。正面光滑，颜色为红棕色，背面颜色灰白，不光滑，与典型的木耳子实体特征相似，可初步鉴定为木耳属菌株。通过在线Blast对比，发现菌株Aa-019与毛木耳（MH213359） 的序列相似度达97.75%，通过对菌株Aa-019和相似度较高的20个种的同源性比较，构建系统发育树见图2。

图1 菌株Aa-019鲜子实体Fig.1 Fresh fruit body of strain Aa-019

图2 菌株Aa-019的系统发育树Fig.2 Phylogentic tree constructed by strain Aa-019

由图2同样发现与毛木耳（MG696594） 亲缘关系最近。根据Landeweert[8]的理论，序列相似性≥99%为同一种，序列相似性<99%，且≤95%时为同属不同种，序列相似性<95%时，该菌株则为同科不同属。结合吴芳等[9]对木耳属各种拉丁名的修订结论，菌株Aa-019与毛木耳种高度同源，但又存在于独立分支上，所以菌株Aa-019（MN294455） 为尚未报道的毛木耳（Auricularia cornea） 菌株。

2.2 不同碳源对菌株Aa-019菌丝生长的影响

不同碳源对菌株Aa-019菌丝生长的影响情况见表1。

表1 不同碳源对菌株Aa-019菌丝生长的影响Tab.1 Effect of different carbon source on mycelial growth of strain Aa-019

由表1可知，不同碳源条件下，菌株Aa-019的菌丝长势和生长速度存在差异。以乳糖为碳源时，菌丝颜色雪白，菌丝长势最好，但菌丝生长速度慢。以甘露醇为碳源的菌丝生长速度最快，且甘露醇添加量为20.0 g·L-1时，菌丝生长速度达6.54 mm·d-1，与其他处理具有显著差异。随着葡萄糖添加量的增加，菌株Aa-019的菌丝生长速度逐渐降低；随着蔗糖添加量的增加，菌丝生长速度变化不大。

2.3 不同氮源对菌株Aa-019菌丝生长的影响

不同氮源对菌株Aa-019菌丝生长的影响结果统计见表2。

由表2可知，菌株Aa-019对氮源的利用程度不同。以酵母粉为氮源时，明显优于其他氮源处理，但菌丝生长速度随酵母粉添加量的增大差异不明显，以蛋白胨和硫酸铵为氮源时也存在类似的现象。结合菌丝长势、菌丝色泽等指标，菌株Aa-019的最适氮源为酵母粉6.0 g·L-1，菌丝生长速度可以达4.87 mm·d-1，其次是蛋白胨和硫酸铵，低浓度的尿素也可以被菌株Aa-019吸收，随着尿素添加量的增加，菌丝生长速度明显降低，这与黄艺宁等[10]的结论相似。

表2 不同氮源对菌株Aa-019菌丝生长的影响Tab.2 Effect of different nitrogen source on mycelial growth of strain Aa-019

2.4 不同温度对菌株Aa-019菌丝生长的影响

不同培养温度对菌株Aa-019菌丝生长的影响结果见图3。

图3 不同温度对菌株Aa-019菌丝生长速度的影响Fig.3 Effect of different temperature on mycelial growth rate of strain Aa-019

由图3可知，温度是影响食用菌生长发育最重要的因素[11]，菌株Aa-019的菌丝生长速度随着温度的变化而不同。在5℃条件下，菌株Aa-019菌丝几乎不生长，在15℃以下，其菌丝生长较为缓慢，20℃时菌丝生长最快，后随着温度的升高，菌丝生长速度减缓，在30℃～35℃时，菌株Aa-019虽能够生长，但出现了菌丝稀疏、菌落不完整等现象。

2.5 不同pH对菌株Aa-019菌丝生长的影响

不同pH对菌株Aa-019菌丝生长的影响见图4。

图4 不同pH对菌株Aa-019菌丝生长速度的影响Fig.4 Effect of different pH on mycelial growth rate of strain Aa-019

由图4可知，该菌株在pH为4.0～9.0时都能生长，pH＜3.0时，菌丝生长缓慢或无明显生长。通过趋势线可得出趋势线方程为：

该趋势方程R2为0.882 1。

菌株Aa-019的适宜pH为5.0～7.0，最佳pH为6.7，即该菌株的理想培养环境为弱酸性。

3 讨论与结论

长期以来，毛木耳的命名存在同物异名的现象[12]，原来毛木耳被命名为A.polytricha[13]，后经过多人研究后认为我国的毛木耳也存在类似情况，根据形态特征和ITS分析，将其学名修订为A.cornea[14]，通过Blast对比结果可知菌株Aa-019为毛木耳。

葡萄糖为单糖，是小分子碳源，是大部分食用菌的培养基首选碳源，但试验中发现，甘露醇能更好的被毛木耳菌株吸收，与王谦等[15]研究结果不同，这可能是由于不同毛木耳菌株的特性造成。在氮源的优化中发现，该菌株不仅可以利用酵母粉、蛋白胨等大分子氮源，而且也可利用硫酸铵等小分子氮源。

在适宜生长温度的筛选和适宜pH的筛选中，发现该菌株的最适温度为20℃，与大多数毛木耳菌株适宜温度在25℃的情况是存在差异。多数毛木耳菌株的最适pH为4.0～7.0，而该菌株却在pH为9.0时还可以生长，表现出了一定的耐碱性。

通过对野生菌株Aa-019形态鉴定法和ITS分析，鉴定野生菌株Aa-019为毛木耳；通过进行野生菌株Aa-019菌丝生长的碳源、氮源、最适温度以及适宜pH等的筛选试验，其菌丝生长的最佳温度条件为20℃，黑木耳Aa-019菌丝在含有甘露醇20.0 g·L-1和酵母粉6.0 g·L-1，且pH为6.7的培养基上生长速度最快。