肝细胞癌组织中调控CDK2基因的靶miRNA的表达

苏文文，许晓义，高 山，林怡彤，宋高臣

(1.牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011；2.深圳大学附属华南医院，广东 深圳 518111)

肝细胞癌(hepatocellar carcinoma,HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤，每年新发病例约85万例[1]。肿瘤的发生是细胞周期失常导致的细胞失控性生长的结果。细胞周期依赖性激酶2(Cyclin dependent kinase2,CDK2)在细胞周期调控中具有核心作用。有研究表明[2]，肝癌细胞中CDK2被特异地沉寂时，Rb、CyclinE、E2F1基因的mRNA表达对CDK2基因的表达有明显的依赖性。微小RNA(micoRNA,miRNA)是一类由18～25个核苷酸构成的非编码单链RNA，主要通过抑制其靶基因的表达而起负性调控作用。miRNA对靶基因的调节机制是通过形成胞浆内RNA沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)而对其靶基因的表达产生基因沉默或者抑制作用[3]。而miRNA沉默功能的缺失可能导致肿瘤相关靶基因表达异常，是引起肿瘤发生、促进肿瘤生长和转移以及抑制肿瘤凋亡的重要因素之一。

为讨论肝细胞癌发生过程中miRNA对靶基因的调控机制，我们建立肝细胞癌发生的miRNA差异表达谱以及筛选肝细胞癌中调控CDK2基因表达的靶miRNA，同时利用qRT-PCR验证miRNA基因芯片分析结果，对差异表达miRNA进行GO富集分析与转录因子分析，初步探讨肝细胞癌中调控CDK2基因表达的靶miRNA，对后续相关机制的研究以及抗肝癌药物开发奠定实验基础和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料从牡丹江市肿瘤医院腹瘤科收集3例肝细胞癌组织(tumor section,TS)及癌旁组织(normal section,NS)标本，均经术后病理确定。RNA提取试剂盒mirVanaTM RNA Isolation Kit、miScriptII Reverse Transcription Kit试剂盒与miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒均购买于Qiagen公司；Nanodrop分光光度计、Agilent 2100生物分析仪、Agilent Microarray Scanner扫描仪(美国Agilent公司)。

1.2 方法

1.2.1 miRNA芯片差异筛选 利用RNA提取试剂盒mirVanaTM RNA Isolation Kit(AM1561)提取组织Total RNA，利用Agilent 2100生物分析仪鉴定样品总RNA的完整性，RNA完整性评分均大于7.0分的标本可用于后续实验。由上海欧意公司基于Agilent芯片分析试剂盒进行miRNA基因芯片分析，采用Agilent Microarray Scanner扫描仪扫描芯片结果。利用miRNA靶基因预测数据库(Targetscan、MiRanda、PicTar)反向预测CDK2相关的miRNA。

1.2.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证芯片差异表达的miRNA 根据miScriptII Reverse Transcription Kit试剂盒说明书合成cDNA，冰上配制Reverse-transcription master mix。在PCR仪中37 ℃孵育60 min，然后95 ℃下孵育5 min，以灭活管中miScript Reverse Transcriptase Mix。将所得cDNA按一定倍数稀释后加入Real Time PCR反应体系中定量检测。下游引物使用Qiagen通用反向引物的miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒中提供的通用引物，上游引物由艾博思公司设计与合成，以人U6 snRNA为内参。配制反应体系，通过ABI stepone定量仪器检测反应结果。采用扩增曲线和溶解曲线来分析检测RT-PCR产物的特异性。结果以CT值显示，即每个反应管内荧光信号达到阈值所经历的PCR循环数，阈值取机器自动默认值。采用相对定量法分析肝细胞癌组织和癌旁组织中miRNA(所逆转录的cDNA)：设置对照组，U6为内参基因，结果(CT值)以平均值±标准差表示，△CT指同一样品中，待检基因与内参基因平均CT值的差值。△△CT=(样本组△CT)-(对照组△CT)，以2-△△CT表示实验组与对照组中miRNA的倍比关系，实验重复3次(n=3)。

1.2.3 miRNA芯片结果与qRT-PCR验证CDK2基因靶miRNA结果对比分析 将临床样本芯片分析miRNA差异表达谱与qRT-PCR验证的CDK2调控靶miRNA进行对比分析，筛选出表达水平相同的miRNA。

1.2.4 基因本体论(Gene Ontology,GO)富集分析与转录因子(Transcription Factor,TF)分析 利用Richfun软件(http://funrich.org/download)对调控CDK2基因的靶miRNA进行GO富集分析和TF分析。通过GO分析中的细胞组成(Cellular Component,CC)、生物过程(Biological Process,BP)、分子功能(Molecular Function,MF)三个过程对miRNA的功能进行多方面的描述。

1.3 统计学分析采用相对定量法分别分析样本差异表达的miRNA(所逆转录的cDNA)与U6内参基因的相对表达量，结果(CT值)以“均数±标准差”表示，计算出2-△△CT值。所得数据对U6内参基因进行标准化处理，实验数据以“均数±标准差”表示，采用SPSS软件作统计学配对t检验分析，P<0.05表示有显著差异。

2 结果

2.1 miRNA芯片差异筛选结果前期研究[4-5]发现肝癌及癌旁组织的miRNA基因芯片表达谱分析共检测到2549个miRNA，其中有174个差异表达的miRNA(FC≥2或<0.5)，上调有97个，下调有77个。利用miRNA靶基因预测数据库(Targetscan、MiRanda、PicTar)反向预测CDK2相关的靶miRNA有54个。将miRNA差异表达谱结果与数据库所查阅的CDK2相关靶miRNA进行比对，筛选出9个miRNA与芯片结果相一致，见图1。如表1所示，包括6个表达上调的miRNA：hsa-miR-18a-5p，hsa-miR-222-3p，hsa-miR-1237-3p，hsa-miR-410-3p，hsa-miR-381-3p，hsa-miR-539-5p；和3个表达下调的miRNA：hsa-miR-214-3p，hsa-miR-375，hsa-miR-200a-3p。

图1 芯片miRNA表达谱与数据库CDK2相关miRNA差异表达的共同miRNA

2.2 与CDK2相关的miRNA的qRT-PCR验证结果表明，与癌旁组织相比，hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-214-3p在肝细胞癌组织中表达水平明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)；而hsa-miR-1237-3p、hsa-miR-410-3p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-539-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-200a-3p在肝细胞癌组织中表达水平显著下调，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见表2。

表2 qRT-PCR验证miRNA在肝细胞癌及癌旁组织中的相对表达量

2.3 临床样本芯片分析miRNA差异表达谱与qRT-PCR验证的CDK2调控靶miRNA的对比分析将qRT-PCR的验证结果分别与miRNA芯片结果数据比对，所验证的9个miRNA中，发现4个miRNA 与芯片结果上下调一致，分别是hsa-miR-18a-5p、hsa-miR-222-3p表现为表达上调，hsa-miR-375、hsa-miR-200a-3p表现为表达下调，结果均具有统计学意义(P<0.01)，见表3。其他5种miRNA比对结果是芯片结果与qRT-PCR验证结果不相符，无后续研究价值。

表3 miRNA芯片结果与qRT-PCR验证CDK2基因靶miRNA结果对比分析

2.4 miR-200a-3p、miR-375、miR-200a-3p和miR-375的GO富集分析与转录因子分析如图2所示，GO富集分析(A)显示miR-200a-3p、miR-375、miR-200a-3p和miR-375的转录因子活性、细胞黏附分子活性、细胞核与胞质、转移酶活性富集程度高。转录因子分析(B)结果表明调控CDK2基因的miRNA匹配到200个转录因子，其中EGR1、SP1、POU2F1、SP4、FOXA1是与miRNA结合强度最靠前的5个转录因子。

图2 细胞组成(CC)、生物过程(BP)、分子功能(MF)的GO富集分析(A)与转录因子分析(B)

3 讨论

细胞周期调控机能紊乱可以引起肝癌细胞失控性生长，本课题组前期研究证明，CDK2与肝癌的发生和发展密切相关，CDK2在细胞周期调控中具有正向推进作用，当机体内CDK2活性异常升高时，促进肿瘤细胞内DNA合成，进而引起肿瘤细胞不断增殖。miRNA是一类小RNA，自身不参与表达但能通过形成沉默复合体(RISC)对靶基因mRNA发挥负性调控作用。因此，我们推测在肿瘤细胞中，表达下调的miRNA可能是调控CDK2基因的靶miRNA，二者存在直接调控关系；表达上调的miRNA与CDK2基因不存在直接调控关系，可能是通过其他途径在肝癌发生中起作用的。所以，我们初步推测miR-200a-3p、miR-375是CDK2靶miRNA，但其确切关系有待利用miRNA模拟物和抑制物干预后检测以及荧光素酶报告基因检测法(Luciferase Assay)等实验方法做进一步确定；miR-18a-5p和miR222-3p在肝癌中表达上调，因此初步确定其与CDK2无直接调控关系，其间接调控机制可能通过其他环节作用产生。通过转录因子分析发现转录因子EGR1、SP1、POU2U1、SP4与FOXA1与差异miRNA结合强度排名前五。有研究表明miR-181a-5p是转录因子EGR1的负调控因子，它可以通过靶向EGR11/TGF-β1/Smad途径抑制HCC中的肿瘤增殖[6]。lncRNA转移相关的肺腺癌转录本1(MALAT1通过海绵化miR-200a-3p作为竞争性内源RNA(ceRNA)来抑制FOXA1表达而降低甲状腺癌的生长[7]。miR-375通过直接结合3'非翻译区(3’-UTR)负调控Sp1转录因子(SP1)蛋白并调节EMT相关基因来抑制大肠癌的侵袭和迁移[8]。

此外，研究发现miR-200a-3p和miR-375在食道癌等多种肿瘤中表达下调并且与肿瘤的发展呈负相关[9]。Chu等研究表明，miR-375在前列腺癌中具有抑制雄性激素效应因子的基因甲基化作用，对前列腺癌的发生发展具有抑制作用[10]；Wang等研究发现，miR-200a-3p能通过靶向抑制SPAG9在肾细胞癌的表达，从而抑制肿瘤的发展并促进其凋亡[11]；Liu等研究发现在肝癌细胞中，miR-375能靶向沉默Hippo 信号通路中的YAP基因的表达，从而抑制肝癌的发生[12]。关于miR-200a-3p和miR-375在调控肝癌CDK2基因表达的相关研究较少。

综上所述，本研究表明miR-200a-3p和miR-375表达与肝癌的发生呈负相关，初步确定miR-200a-3p和miR-375是调控肝癌中CDK2基因表达的靶miRNA。本实验为肝癌发生机制的进一步研究提供理论依据。