荔枝啤酒发酵特性及工艺参数优化

苗俨龙，龚诗媚，王凯，赵雷，涂京霞，杨青，王玉海，胡卓炎*

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.广州南沙珠江啤酒有限公司，广东广州 511462）

啤酒是以大麦芽、啤酒花为原料，由啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiar）发酵而成[1]。啤酒富含碳水化合物，氨基酸，矿物质以及多酚类物质，适当饮用啤酒具有调节免疫，预防心血管疾病等作用[2-3]。近年精酿（工坊）啤酒在啤酒市场上呈快速增长的趋势，其中水果啤酒是工坊啤酒中最受欢迎的品类之一，兼具啤酒的清爽口感，水果独特的香甜风味和丰富的营养特性而深受消费者喜爱[4-5]。研究表明在啤酒酿造工艺中添加枸杞[6]、山茱萸[7]、沙棘[8]等可以提高成品啤酒的多酚含量和抗氧化活性。天然果蔬原料的添加和活酵母的存在赋予工坊啤酒新的感官特性和多样性，同时保留并提高了更多生物活性物质的含量[9]。添加枸杞酿造的啤酒中的芦丁和2-O-β-D-吡喃葡萄糖-L-抗坏血酸含量较高[6]，添加山茱萸酿造的啤酒中含有丰富的环烯醚萜类[7]，添加茄子皮酿造的啤酒中富含花青素[10]等。除此之外，还有研究人员探究了加入山楂、榲桲和柿子等对成品啤酒理化性质的影响[11-13]。果蔬等天然原料中含有的生物活性物质，不仅有可能减少酒精对人体机体的氧化和毒性作用，同时也可以改善啤酒品质指标，防止微生物污染等[14]。

荔枝是一种热带和亚热带水果，果肉风味独特，营养丰富，含有丰富的糖类、氨基酸、维生素等[15]。研究表明荔枝果肉中具有丰富的多糖及多酚类物质，具有抗氧化、降血脂、护肝、免疫调节等功效[16]。此外，荔枝中含有丰富的γ-氨基丁酸，是苹果、猕猴桃等水果的100 倍[17,18]。研究表明γ-氨基丁酸能够作为抑制性神经递质参与大脑调节，具有抗焦虑、降血压、调节心血管健康，预防慢性酒精相关疾病等功效[19]。由于成熟期集中，加工压力大、要求高，不耐贮藏等原因，荔枝加工产品种类少，仍以荔枝干，荔枝罐头，荔枝汁为主，不足以体现荔枝作为一种传统珍稀水果的市场价值和优势[20,21]。

本研究探讨了原麦汁浓度、荔枝果浆和啤酒花添加量对荔枝啤酒理化性质的影响，在此基础上通过响应面（response surface methodology，RSM）法对荔枝啤酒酿造工艺进行优化，为荔枝啤酒开发提供理论依据，有助于综合利用荔枝资源，促进荔枝深加工产业进一步发展，延长荔枝产业链。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荔枝（Litchi chinensisSonn.），品种为黑叶，产地为广东，成熟鲜果采后经挑选清洗于-18 ℃下冻藏备用；大麦芽，购于保定欧麦麦芽公司；啤酒酵母S-23，法国Fermentis 公司；啤酒花，美国雅基玛酒花公司。甲醇、无水乙醇、无水醋酸钠、碳酸钠等均为国产分析纯。

数字式折射仪，日本ATAGO 公司；TUV-2600紫外可见分光光度计，日本岛津公司；LRH-50CL 培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；DMA 4500 啤酒分析仪，奥地利Anton Paar 公司；TGL-20M 离心机，湖南湘仪公司；数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 荔枝啤酒制作工艺

荔枝果浆制备：冻藏荔枝解冻至0～5 ℃左右，在低温下去皮去核，果肉经破碎打浆；荔枝啤酒制作工艺参考Ducruet 等[5]和Kawa-Rygielska 等[6]的方法，并略作修改：

麦芽→粉碎→糖化（料水比：1:3.5；分步糖化：52 ℃ 30 min；66 ℃ 60 min；76 ℃ 10 min）→洗糟、过滤，获得麦汁→煮沸30 min（煮沸期间添加啤酒花，煮沸10 min 时添加苦型啤酒花，煮沸25 min 时添加香型啤酒花，比例为1:1）→冷却至25 ℃→接种啤酒酵母0.6 g/L（酵母提前在25 ℃无菌水中活化30 min 备用）→投料荔枝果浆→主发酵，在2 L 的玻璃发酵罐中进行，12 ℃下糖度连续48 h 无变化→升温至18 ℃进行双乙酰还原，至双乙酰含量≤0.10 mg/L→分离发酵液，按6 g/L 计算葡萄糖加入量，混匀→装入250 mL 棕色啤酒瓶，12 ℃下进行瓶内二次发酵14 d→ 4 ℃ 贮藏

1.2.2 单因素实验

以感官评价分数为指标，按照以下步骤进行单因素实验。

原麦汁浓度：固定啤酒花添加量0.4 g/L，荔枝添加量为20%（V/V）。考察不同原麦汁浓度（8、10、12、14 和16oP）对成品啤酒理化特性和感官评价分数的影响。

荔枝果浆添加量：固定原麦汁浓度10oP，啤酒花添加量0.4 g/L。考察不同荔枝果浆添加量为5%（V/V）、10%（V/V）、15%（V/V）、20%（V/V）和25%（V/V）时对成品啤酒理化特性和感官评价分数的影响。

啤酒花添加量：固定原麦汁浓度10oP，荔枝添加量为20%（V/V）。考察不同啤酒花添加量（0.1、0.2、0.3、0.4 和0.5 g/L）对成品啤酒理化特性和感官评价分数的影响。

1.2.3 响应面试验

根据单因素实验的结果，利用Design-Expert 8.0软件Box-Behnken 设计，以A（原麦汁浓度）、B（荔枝果浆添加量）、C（啤酒花添加量）为变量，以感官评价分数作为响应值，设计三因素三水平的中心组合实验，每组重复三次，取其平均值。因素水平如表1所示。

表1 Box-Behnken 设计因素水平表Table 1 Variables and levels used in Box-Behnken design

1.2.4 啤酒理化指标测定

样品预处理：超声15 min 除气；4 ℃条件下10000 r/min 离心10 min，过滤，备用。啤酒发酵度、酒精度、残糖均采用安东帕DMA 4500 啤酒分析仪测定。啤酒泡持性、苦度按照《GB/T 4928-2008 啤酒分析方法》测定。

1.2.5 啤酒感官评价

由10 名经过专业培训的具有啤酒品评经验的人员组成感官评价小组，以外观、泡沫、香气、口味为评价因素。感官评分标准如表2 所示。

表2 荔枝啤酒感官评分标准Table 2 Sensory scoring criteria of the litchi craft beer

1.2.6 微生物指标

大肠杆菌：参照《GB4789.3-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》进行测定；金黄色葡萄球菌和沙门氏菌：参考《GB 29921-2013 食品安全国家标准食品中致病菌限量》测定。

1.3 数据处理

采用Origin 2017 软件和SPSS Statistics 19.0 软件对实验数据进行整理作图和统计学分析，各组数据表示为平均值±标准差。差异性检验使用Duncan’s 法，p＜0.05 表示差异具有显著性。采用Design-Expert 8.0数据处理专家进行响应面试验设计和分析。所有实验均重复三次。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 原麦汁浓度对荔枝啤酒发酵特性的影响

不同原麦汁浓度对荔枝啤酒的发酵特性具有显著影响（p＜0.05），如表3 所示。

表3 原麦汁浓度对荔枝啤酒理化性质的影响Table 3 The effect of original extract level on fermentation characteristics of litchi craft beer

结果表明，随原麦汁浓度增加，啤酒发酵度降低，残糖含量升高，酒精度增加；泡持性、苦度均随麦汁浓度增加而升高，但感官评分并没有随原麦汁浓度增高而增加，10oP 的荔枝啤酒感官评分最高，为75.40分。上述结果的原因可能是原麦汁浓度越高，氮源和碳源含量增加，导致更多乙醇生成，发酵度升高。汪中世[22]研究了8～16oP原麦汁浓度对蓝莓啤酒的影响，结果表明成品蓝莓啤酒的酒精度随原麦汁浓度增加而增加，这与本研究结果一致。王松廷[23]比较了8、12、15和20oP的原麦汁浓度对西瓜啤酒理化指标的影响，发现成品西瓜啤酒的残糖含量随原麦汁浓度升高而升高，这与本文研究结果一致；但成品西瓜啤酒的发酵度随原麦汁浓度升高而升高，这和本研究结果不符，这可能是因为所用西瓜本身含糖量较低，实验所用酵母及发酵工艺不同的原因造成的。麦汁浓度增加，会使得发酵液粘度增大，可能不利于酵母与底物作用，导致残糖量升高[24]。麦汁浓度越高，泡持蛋白含量增加，泡持性增强[25]。综合比较，选择原麦汁浓度8、10、12oP 进行响应面实验。

2.1.2 荔枝添加量对荔枝啤酒发酵特性的影响

不同荔枝果浆添加量对啤酒的发酵特性具有显著影响（p＜0.05），如表4 所示。

表4 荔枝果浆添加量对荔枝啤酒理化性质的影响Table 4 The effect of litchi juice addition level on fermentation characteristics of litchi craft beer

随荔枝果浆添加量增多，发酵度和酒精度升高，残糖、泡持性、苦度降低。荔枝果浆添加量为15%（V/V）时，感官评分最高。这可能是因为荔枝中含有丰富的可发酵糖类如葡萄糖和果糖，而麦汁中主要是麦芽糖，当葡萄糖增多时，会遏制酵母吸收其他糖类，促进酵母产生更多乙醇[26]。汪中世[22]和Kawa-rygielska[7]等研究发现添加蓝莓和山茱萸酿造的啤酒发酵度增大，酒精度增加，残糖降低，这与本研究结果一致。Martínez[13]比较了75%、50%、25%比例添加柿子汁发酵对成品啤酒品质的影响，发现成品啤酒的酒精度随柿子汁添加比例添加增加而显著增加，酒精度最高是75%比例组，不添加柿子汁的对照组最低，这和本研究结果基本相符。王松廷[23]探究了5%到30%范围的西瓜汁添加量对成品啤酒的影响，发现随西瓜汁添加量升高，成品啤酒的残糖降低，发酵度升高，这和本研究结果一致，但酒精度呈降低趋势，和本研究结果不符这可能是因为西瓜和荔枝相比，含糖量低，而越高比例的西瓜汁投入，降低了本身麦芽汁的浓度，体系中总的可发酵糖含量降低，使得酒精度呈现降低的趋势。荔枝果浆的添加，降低了苦味质浓度，相对减少了酒花中稳定泡沫的物质如律草酮和泡持蛋白的含量，使得泡持性逐渐下降[27]。综合比较，选择荔枝添加量10%（V/V）、15%（V/V）和20%（V/V）进行响应面实验。

2.1.3 啤酒花添加量对荔枝啤酒发酵特性的影响

啤酒花添加量对啤酒的发酵度、残糖和酒精度无显著影响（p＞0.05），对成品啤酒的泡持性和苦度影响显著（p＜0.05），如表5 所示。

表5 啤酒花添加量对荔枝啤酒发酵特性的影响Table 5 The effect of hop addition level on fermentation characteristics of litchi craft beer

随啤酒花用量提高，泡沫持久性、苦度值均显著增加。啤酒花的添加可以有助于提升泡沫稳定性，提高多酚含量，抑制老化前驱物的生成，增强成品啤酒风味稳定性[28]。但啤酒花用量越高，苦度值也相应升高，会导致苦味不协调，可能会覆盖荔枝果香[22]。综合比较啤酒花添加量对荔枝啤酒发酵特性和感官特性的影响，选择酒花添加量0.3、0.4 和0.5 g/L 进行响应面实验。

2.2 荔枝啤酒工艺的响应面优化

2.2.1 回归模型的建立

选择原麦汁浓度（A）、荔枝果浆添加量（B）、啤酒花添加量（C）为三个因素，感官评价分数（Y）为响应指标，进行三因素三水平的响应面实验分析，试验结果和方差分析见表6 和表7。将表6 的数据用Design.Expert 8.0 软件进行二次线性回归拟合，得到如下回归方程：

表6 响应面实验设计与结果Table 6 The design and result of response surface experiment

表7 Box-Behnken 试验结果模型方差分析Table 7 Variance analysis of response surface method

由该方程知，二次项A2、B2、C2系数均为负，说明该方程存在最大值。由表7 可知，二次回归模型达到极显著水平（p＜0.01）,模型的决定系数R2为0.9814.说明该模型能解释98.14%响应值的变化，失拟项P值不显著，说明该模型拟合程度较好，试验结果具有良好的准确度与可靠性。该模型变异系数CV 为2.23，说明模型的重现性较好，可用于分析与预测不同工艺条件下荔枝啤酒的综合评分。由回归模型的F值可知各参数对综合评分的影响大小为荔枝果浆添加量＞啤酒花添加量＞原麦汁浓度。

2.2.2 交互作用分析

各工艺因素交互项对感官评分的影响作用结果见图1。等高线的密集程度反映了试验因素对响应值的影响作用[29]。从图1 中可以看出原麦汁浓度、荔枝添加量、酒花添加量三个因素两两之间均具有较强的交互作用，等高线呈椭圆形，响应面为凸形，有最大值。从中还可以看出，等高线沿荔枝添加量轴向最密集，沿原麦汁浓度轴向的等高线相对稀疏，沿酒花添加量的等高线最稀疏。表明荔枝添加量对感官评价分数的影响最大，其次是原麦汁浓度，最后是酒花添加量，这与前述的方差分析结果相符。

图1 各因素交互作用对荔枝啤酒感官评分影响的响应面和等高线图Fig.1 Response surface plots showing the effect of original gravity,the addition of hop amount and litchi amount on the sensory scores

2.2.3 工艺优化及验证

用Design Expert 8.0 软件对表6 中的数据进行分析，以啤酒的感官分数最高为目标，运行优化程序获得优化工艺参数条件为原麦汁浓度9～11oP、荔枝果浆添加量11%（V/V）～15%（V/V）、啤酒花添加量0.39～0.44 g/L，此条件下啤酒的感官评价预测分数≥78，如图2所示。综合考虑因素及实际生产条件，确定原麦汁浓度10oP，荔枝果浆添加量15%，啤酒花添加量0.4 g/L为最佳优化工艺参数，重复验证实验三次，荔枝啤酒的感官评价分数平均为78.10 分，实验值与预测值相符，具有荔枝果香的特征。该工艺下的荔枝啤酒理化指标和微生物指标如表8 所示。

图2 荔枝啤酒工艺参数的优化条件Fig.2 Optimum conditions of brewing parameter for litchi craft beer

表8 荔枝啤酒理化指标和微生物指标Table 8 The physicochemical and microbial parameters of finished litchi craft beer

3 结论

在对原麦汁浓度、荔枝果浆添加量和啤酒花添加量三种单因素对啤酒的发酵特性和品质指标影响的基础上，通过响应面法优化实验对荔枝精酿啤酒酿造工艺进行优化，综合因素和实际生产优选最佳工艺条件为：原麦汁浓度10oP，荔枝果浆添加量15%（V/V），酒花添加量0.40 g/L，经试验验证，荔枝啤酒感官评价分数平均为78.10 分，与预测值相符，该工艺下获得的成品啤酒荔枝果香明显，口味纯正，泡沫细腻。响应面法可以用于优化荔枝啤酒酿造工艺，具有一定的准确性和可靠性。研究结果为荔枝深加工产业提供了一条新的途径。啤酒体系复杂，其整体风味是多种物质共同作用的结果，荔枝啤酒的风味和适饮性，还需结合实际生产；添加荔枝对啤酒多酚种类，贮存稳定性和功能特性的影响亟需进一步研究。