斗米虫蛋白对4T1 荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

侯沛颖，孙媭，黄秀凤，王毅，鲍庆华，欧阳东兴，徐华潮*

（1.浙江农林大学林业与生物技术学院，浙江杭州 311300）（2.杭州富阳国有农林资产经营有限公司，浙江杭州 311400）

关键字：斗米虫蛋白；4T1 荷瘤小鼠；体内抗肿瘤

斗米虫，异名云实蛀虫，主要是指寄生于豆科植物云实（Caesalpinia decapetala(Roth)Alston）树茎中的锈色粒肩天牛（Apriona swainsoniHope）和桑天牛（Apriona germari）的天牛全虫幼虫[1]，古人常用一斗米来换取一条虫，故称此虫为斗米虫。早在《中华本草》中就记载了斗米虫有治疗劳伤、透疹和增强筋骨的药用价值，《本草纲目》一书中记载食用此虫可治疗小儿疳积、麻毒内陷、筋骨疼痛、肝硬化等疾病。江西上饶及浙江某些地区不少癌症病人长期食用斗米虫，病情都有所好转[2]。

当前治疗肿瘤的主要手段是化疗，但经过化疗人体会产生许多毒副作用如损伤免疫功能、损害胃肠道、破坏肝功能和骨髓抑制等，这些毒副作用限制了化疗药物疗效的进一步提高和发展。中医认为肿瘤的发病根基是气血两亏，且在临床常常见到痰凝、血瘀等症状，因此中医治疗以活血化瘀、扶正培本、软坚散结、清热解毒、利湿逐水为主[3]。目前药用昆虫在治疗肿瘤的研究中已发现有增效减毒作用，而且能增加肿瘤对化疗药物的敏感性[4]。例如，斑蝥素对人低分化胃癌细胞细胞有显著抑制作用，且对比于其他抗肿瘤药物可以显著激活骨髓的活性，以增强生物体自身的免疫力抵御肿瘤[5]；蟑螂提取物具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、增强肌体免疫力等作用[6-7]；蛴螬提取物对人胃癌细胞、人宫颈癌细胞具有诱导凋亡作用[8-10]等。因此，越来越多的研究者开始关注新型抗肿瘤药物的研发，从天然药用昆虫中发现高效、低毒且特异性调节癌细胞增殖和转移的成分，利用药用昆虫治疗肿瘤或者辅助治疗肿瘤达到增效减毒的目的，则具有极其重要的意义。

鉴于其临床应用前景及广阔的市场前景，课题组前期对斗米虫开展了相关研究。首先关于斗米虫的人工饲养技术探究，基于虫体生长指标、营养成分、保护酶活性三方面筛选出了适合斗米虫生长的饲料配方，为人工大规模养殖斗米虫提供理论依据[11]。其次关于食用斗米虫微生物安全性评价方面，基于高通量测序技术发现新鲜斗米虫存在多种潜在腐败细菌和食物病原体，但经过热处理等有微生物灭活效果的加工流程可避免或最小化食用昆虫带来的微生物风险，这可对食用昆虫卫生标准提供参考依据[12]。对于斗米虫蛋白抗肿瘤功效方面的研究，已有体外抗肿瘤效果初探：斗米虫蛋白能抑制小鼠胃癌细胞（MFC）和小鼠乳腺癌细胞（4T1）的增殖，抑制4T1 细胞的迁移率，且能诱导4T1 及MFC 细胞凋亡，斗米虫蛋白能促进小鼠单核巨噬细胞（RAW264.7）细胞增殖，提高其吞噬活性，说明斗米虫蛋白具有较强的体外抗肿瘤活性及免疫调节活性[13]。本实验以斗米虫蛋白为对象，通过构建BALB/c-4T1 荷瘤小鼠模型来研究斗米虫蛋白的体内抗肿瘤作用，这将为斗米虫的蛋白活性价值研究及其保健食品的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料与试剂

实验用斗米虫（经浙江农林大学徐华潮教授鉴定为锈色粒肩天牛幼虫）200 条，购自江西省上饶市横峰县斗米虫养殖场。

RPMI1640、青-链霉素、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶均购自美国Gibco 公司；荧光素钾盐购自上海普飞生物有限公司。

1.1.2 实验动物与供试瘤株

雌性SPF 级BALB/c 小鼠40 只，18～22 g，6～8周龄，由中国科学院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005。

本实验BALB/c 小鼠在浙江中医药大学动物实验研究中心SPF 级小鼠饲养室饲养，使用许可证号：SYXK(浙)2018-0012，饲养条件：恒温（22±2 ℃），保湿（50%～60%），光照每12 h 明暗交替，换风次数15～20 次／h。每日两次即8:00～9:00 和15:00～16:00定时喂养试验小鼠。所有实验步骤均严格按照中国关于实验动物使用和护理的立法进行，经浙江中医药大学动物福利与伦理审查委员会批准，伦理审批号：20200706-08。

小鼠乳腺癌4T1 细胞株，购自于中国科学院上海细胞研究所。

1.1.3 仪器设备

台式高速冷冻离心机（H1650R），湖南湘仪实验仪器开发有限公司；台式低速离心机（TD5A），湖南凯达实业发展有限公司；小动物麻醉呼吸机，美国Hallowell 公司；IVISLuminaLT 型小动物成像系统，美国Caliper 公司。

1.2 方法

1.2.1 斗米虫总蛋白提取

取200 条，单头体质量为1.70 g 左右，虫龄为5龄的新鲜斗米虫，放入-80 ℃冰箱中冷冻处死，随后置于冷冻干燥机中，脱水干燥5 d 后取出幼虫。将冻干的虫体研磨成粉状，加入500 mL预冷的PBS buffer。冰浴超声提取30 min，4 ℃冰箱提取过夜。4 ℃，12000 r/min 离心15 min，取上清，舍弃沉淀，冷冻干燥[13]。

1.2.2 细胞培养和收集

用含10%胎牛血清50 IU/mL 青霉素50 μg/mL 链霉素的RPM1640 培养基作为小鼠乳腺癌4T1 细胞的培养液，置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱内培养细胞。待复苏后第3 代细胞长至70%～80%融合，用0.25%胰酶消化3～5 min，1000 r/min 离心5 min，弃去上清液，PBS 洗涤3 次，计数，细胞浓度调整至5×106cells/mL。

1.2.3 BALB/c-4T1 荷瘤小鼠模型建立

参考相关文献[14-16]，取体重为18～22 g 的BALB/c雌性小鼠40 只，自由采食和饮水，预适应一周后开始进行实验。小鼠用异氟烷呼吸麻醉，仰卧固定，在BALB/c 小鼠右侧倒数第2 对乳腺脂肪垫处，注入100 μL 4T1 细胞悬液，每只小鼠接种5×105cells，制作BALB/c-4T1 荷瘤小鼠模型，注射后出现局部包块，无细胞悬液渗出及出血，每日观察小鼠和肿瘤生长情况，接种后一周，开始第一次给药。

1.2.4 分组及给药

40 只小鼠接种后按体重随机分为5 组，斗米虫蛋白低剂量组（50 mg/kg 体重，ig）、斗米虫蛋白中剂量组（100 mg/kg 体重，ig）、斗米虫蛋白高剂量组（200 mg/kg 体重，ig），顺铂（DDP）阳性药对照组（30 mg/kg，ip）和模型对照组（等体积生理盐水），每组8 只。按0.1 mL/10 g 体重的给药体积配制为相应浓度，斗米虫蛋白低、中、高试验组和模型对照组每日灌胃给药，连续27 d，顺铂阳性药组每周三次（隔日）腹腔注射给药，周期27 d。每日观察小鼠饮食、活动及死亡情况。

1.2.5 指标测定

1.2.5.1 斗米虫蛋白对4T1 荷瘤小鼠体重及肿瘤的影响

从给药后，开始每周三次（隔日）用电子天平给荷瘤小鼠称重和用游标卡尺进行活体肿瘤大小测量（包括肿瘤最大长径a和肿瘤横径b）。参见相关文献[17-19]，相关计算公式如下：

1.2.5.2 斗米虫蛋白对4T1 荷瘤小鼠脏器质量及指数的影响

第28 d 处死小鼠，用电子天平给小鼠称重，眼眶静脉采血，颈椎脱臼处死小鼠后，剥离肿瘤组织和各脏器，用生理盐水洗涤，然后用滤纸吸干称重。根据以下公式[3,20]，计算荷瘤小鼠各主要脏器指数：

1.2.5.3 小动物成像系统检测体内4T1 肿瘤细胞生长情况

给药第7、14、21 d 时，各组小鼠腹腔注射100 μL/10 g 的15 mg/mL 荧光素钾盐酶底物（剂量为150 mg/kg），底物腹腔注射15 min 后，用麻醉机进行异氟烷麻醉后，置于小动物活体成像仪中观测小鼠乳腺癌肿瘤细胞生长情况。

1.2.6 统计学分析

运用SPSS 21.0 软件对实验数据进行统计分析，结果均采用以均值±标准误表示（mean±SEM），多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），p＜0.05 表示差异有统计学意义。统计数据采用GraphPadprism 6 软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 荷瘤小鼠一般情况

整个实验过程中，各组别BALB/c-4T1 荷瘤小鼠（除阳性对照组）饮水、进食均正常，而阳性对照组给药一段时间后食欲表现欠佳；各组别荷瘤小鼠均未见有坚毛、运动失调或活动受限、呼吸困难、烦躁等反应，所有小鼠均能耐受实验。

2.2 斗米虫蛋白对4T1 荷瘤小鼠体重的影响

小鼠的体重变化被认为是评价安全性的指标之一，体质量呈缓慢增长趋势都是符合荷瘤小鼠的正常生长情况的。由图1 可知：模型对照组和斗米虫蛋白各剂量组，小鼠体重均呈现缓慢上升趋势，而阳性对照组在给药一段时间后，体重呈现下降趋势。如表1 所示：给药前，与模型对照组相比，各组荷瘤小鼠体重均无统计学差异；给药后，与模型对照组相比，斗米虫蛋白各剂量组均无显著差异性，说明斗米虫蛋白对小鼠没有明显的药物毒性，而阳性对照组具有统计学差异（p＜0.05）。荷瘤小鼠体重增长量最大的是斗米虫蛋白高剂量组（200 mg/kg），体重变化率由大到小依次为：斗米虫蛋白高剂量组（+8.96%）＞模型对照组（+6.86%）＞低剂量组（+6.67%）＞中剂量组（+3.70%）＞DDP 组（-12.62%）。阳性对照组荷瘤小鼠体重呈负增长趋势，可能是因为化疗药物在抑制肿瘤过程中，会致使荷瘤小鼠食欲不振，对机体有较强的毒副作用。

图1 不同处理方式对4T1 荷瘤小鼠体重的影响Fig.1 Effect of different treatment methods on body weight in 4T1 tumor-bearing mice

表1 不同处理方式对4T1 荷瘤小鼠给药前后体重的影响（mean±SEM）Table 1 Effect of different treatment methods on body weight before and after dosing in 4T1 tumor-bearing mice

综合以上，表明斗米虫蛋白对4T1 荷瘤小鼠体重无显著影响，小鼠生长环境适宜，与顺铂相比，不会引起小鼠食欲不振，具有对荷瘤小鼠体重无影响的优势。

2.3 斗米虫蛋白对4T1 荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

2.3.1 斗米虫蛋白对4T1 荷瘤小鼠肿瘤体积的影响

由图2 可知：模型对照组荷瘤小鼠肿瘤生长正常，而阳性对照组和斗米虫各剂量组荷瘤小鼠肿瘤体积增长速度变慢。从图3 可以看出：模型对照组肿瘤体积增长量最大，阳性对照组肿瘤体积增长量最小，斗米虫蛋白各剂量组则介于中间；给药前，与模型对照组相比，各组别荷瘤小鼠肿瘤体积均无统计学差异；给药后，与模型对照组相比，阳性对照组和斗米虫蛋白中浓度剂量组（100 mg/kg）的肿瘤体积增长量具有统计学差异性（p＜0.05），肿瘤体积抑制率分别为38.57%和23.08%。

图2 不同处理方式对4T1 荷瘤小鼠肿瘤体积的影响Fig.2 Effect of different treatment methods on tumor volume in 4T1 tumor-bearing mice

图3 不同处理方式对4T1 荷瘤小鼠肿瘤体积增长量的影响Fig.3 Effect of different treatment methods on tumor volume growth in 4T1 tumor-bearing mice

2.3.2 斗米虫蛋白对4T1 荷瘤小鼠肿瘤质量的影响

实验结束后，脱颈处死小鼠，摘取肿瘤称重并拍照，肿瘤实物图见图4。

图4 不同处理方式4T1 荷瘤小鼠肿瘤实物图Fig.4 Tumor images of different treatment methods on 4T1 tumor-bearing mice

结合表2 可发现，阳性对照组肿瘤质量最小，斗米虫蛋白中剂量组次之，且与模型对照组相比，均有显著差异性（p＜0.05），而中剂量组与阳性对照组相比，肿瘤质量无统计学差异性（p＞0.05），表明斗米虫蛋白中剂量组（100 mg/kg）在体内对4T1 肿瘤有较强的抑制效果，这与孙媭等[13]研究结果相互印证。孙媭等研究发现，斗米虫蛋白体外可以抑制4T1 细胞的迁移，诱导4T1 细胞的凋亡，能显著抑制4T1 细胞的增殖作用（p＜0.05），体外4T1 细胞增值抑制率最高能达到53%。本实验肿瘤质量抑制率从高到低依次为：阳性对照组（48.08%）＞斗米虫蛋白中剂量组（36.06%）＞低剂量组（23.08%）＞高剂量组（21.63%）。

表2 不同处理方式对4T1 荷瘤小鼠肿瘤质量的影响（mean±SEM）Table 2 Effect of different treatment methods on tumor weight in 4T1 tumor-bearing mice (mean±SEM)

综合以上，表明斗米虫蛋白在体内对4T1 肿瘤生长有一定抑制作用，且斗米虫蛋白中剂量组（100 mg/kg）体内抑制4T1 肿瘤效果最显著，抑瘤率达到36.06%。

2.4 斗米虫蛋白对4T1 荷瘤小鼠脏器质量及脏器指数的影响

从图5 可看出，阳性对照组荷瘤小鼠的各主要脏器质量最小，斗米虫蛋白各剂量组与模型对照组的各主要脏器质量相比没有显著差异性，而与阳性对照组相比具有统计学差异性（∆p＜0.05）；与模型对照组相比，仅有阳性对照组荷瘤小鼠的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏质量明显降低，具有统计学差异性（*p＜0.05），说明顺铂会对荷瘤小鼠各主要脏器表现出一定的毒副作用，而斗米虫蛋白则未表现出明显毒副作用。

图5 不同处理方式对4T1 荷瘤小鼠主要脏器质量的影响Fig.5 Effects of different treatment methods on the main viscera weight in 4T1 tumor-bearing mice

如表3 所示：就心脏指数、肺脏指数、肾脏指数而言，各处理组之间均无统计学差异性；与模型对照组相比，阳性对照组的肝脏指数和脾脏指数显著降低（*p＜0.05），而斗米虫蛋白各剂量组均无显著差异性，说明顺铂对脏器有一定的毒害作用，而斗米虫蛋白组未表现明显毒副作用。

表3 不同处理方式对4T1 荷瘤小鼠主要脏器指数的影响（mean±SEM）Table 3 Effects of different treatment methods on the main viscera index of 4T1 tumor-bearing mice (mean±SEM)

脾脏属于免疫器官，其与机体免疫反应的发生息息相关。本实验结果显示，阳性对照组的脾脏质量和脾脏系数与模型对照组相比均显著减小（p＜0.05），说明顺铂在一定程度上抑制了荷瘤小鼠机体免疫作用。而斗米虫蛋白各剂量组的脾脏质量和脾脏指数与模型对照组相比虽均无统计学差异，但有减小的趋势，推测斗米虫蛋白可能通过免疫调节的方式发挥体内抗肿瘤作用。孙媭等[13]体外试验表明：斗米虫蛋白能促进巨噬细胞（RAW264.7）的细胞增殖作用（p＜0.05），提高RAW264.7 吞噬活性、NO 释放量、TNF-α、1L-1β和IL-6 分泌量及TNF-α、IL-1、TLR4、MIR-7、IFN-γ和IL-6 细胞因子的mRNA 水平以及能显著下调4T1 细胞中MMP2、MMP9、STAT3、c-Myc和Sdf1mRNA 水平（p＜0.05，p＜0.01），斗米虫蛋白还能明显增加RAW264.7 细胞MyD88 和TRIF 蛋白的表达量，证实了斗米虫蛋白在体外具有潜在免疫调节作用。而关于斗米虫蛋白体内是否通过免疫调控的途径以参与抗肿瘤的过程，还需进行下一步的探讨和补充。

综合以上，表明斗米虫蛋白对荷瘤小鼠各主要脏器无明显毒副作用，与顺铂相比，具有对荷瘤小鼠各主要脏器无明显毒害的优势。

2.5 小动物成像系统检测体内4T1 肿瘤细胞生长情况

小动物成像系统可以检测荷瘤小鼠4T1 肿瘤细胞荧光信号。由图6 可以看出：模型对照组荷瘤裸小鼠随着接种时间的延长，荧光信号也不断升高，说明肿瘤生长良好。与模型对照组相比，斗米虫蛋白各剂量组荧光信号相对减弱，但不及阳性对照组，与肿瘤生长情况相符合，表明斗米虫蛋白在体内对4T1 肿瘤细胞有一定的抑制作用。

图6 不同处理方式的荷瘤小鼠IVIT 成像Fig.6 IVIT imaging of 4T1 tumor-bearing mice treated with different treatment methods

3 结论

本实验表明：斗米虫蛋白呈现出一定的体内抑制4T1 肿瘤细胞作用，且对4T1 荷瘤小鼠机体或各主要脏器无明显毒副作用。斗米虫蛋白剂量为100 mg/kg时，对体内肿瘤抑制效果最强，抑瘤率达到36.06%。但是针对其抗肿瘤机理，是否是通过免疫调节能力来抵御肿瘤细胞，还有待进一步探究。