GC-MS 法结合酸酯化预处理测定不同地区油茶籽油脂肪酸含量

唐旭晓，张应中，王静，张盟雨，徐煲铧

（广东省森林培育与保护利用重点实验室，广东省林业科学研究院，广东广州 510520）

油茶（Camellia oleiferaAbel.）属山茶科山茶属，在我国已有两千多年的栽培和利用历史[1]，广泛分布于南方大部分省份的丘陵地区，与核桃、乌桕和油桐并称为我国四大木本油料树种，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本油料树种[2]。油茶籽油（C.oleiferaseeds oil），简称茶油，是油茶成熟种子中提取的我国特有的木本食用油脂[3]，具有延缓动脉粥样硬化[4]、预防心血管疾病、保肝凉血、抗氧化、抗肿瘤、降血压等保健功能[5-9]，有“长寿油”之称。

脂肪酸的构成（种类、含量和比例等）是衡量油脂品质的重要指标，很大程度上决定了食用油的营养价值[10]，茶油中的脂肪酸易受产地、品种、加工工艺、贮藏条件等影响，进而影响茶油品质和营养。油茶种植因受土壤、气候、海拔等影响，使得不同产地的茶油营养价值各不相同。近几年，对不同地区中茶油营养成分的差异性研究越来越关注。叶敏倩等[11]对湖北、江西、浙江、湖南等地茶油中甾醇、角鲨烯、生育酚、脂肪酸等主要特征组分进行了分析，结果表明湖南茶油具有较高的特征组分。王亚萍等[12]对江西、湖南、福建、四川等地油茶籽中脂肪酸进行了差异性分析，在检测出的10 种脂肪酸中饱和脂肪酸含量差异显著，不饱和脂肪酸含量差异不显著。何小三等[13]对江西省36 个地区茶油进行分析，指出9 种脂肪酸各组分间具有极显著的相关性。王召滢等[14]对江西省内30个地区茶油脂肪酸进行指纹图谱分析，检测出9 种共有脂肪酸，绘制了茶油脂肪酸组成谱系图。杨凯等[15]对浙江、湖南、广西、江西等地茶油脂肪酸进行分析，共检测出8 种脂肪酸，指出江西茶油品质最高。因此，分析不同地区茶油的脂肪酸组成及含量差异，有利于更全面地了解各地区茶油的特色营养。

脂肪酸测定常用的预处理方法有酯化法、三氟化硼法、三甲基氢氧化硫法和三甲基硅重氮甲烷法等[16-19]。在选择酯化预处理方法中，需根据测定目标脂肪酸进行选择，不同方法中脂肪酸甲酯化程度不同，使测得的脂肪酸构成各不相同，甚至差异较大[16-18]。范亚苇等[17]比较了酸酯化、碱酯化和三甲基硅重氮甲烷法，结果表明三种方法检测出脂肪酸含量分别为64.13%、72.37%和82.47%。寇秀颖等[18]对酸酯化和碱酯化方法进行了比较，结果表明这两种方法检测出脂肪酸含量分别为63.28%和3.26%。本研究在比较酸酯化和碱酯化方法基础上，采用气相色谱-质谱联用技术，分析湖南、广东、江西、海南、广西和云南6 个地区茶油的脂肪酸含量差异，以期为探讨各地区油茶特征品质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 原料

油茶籽分别采集于湖南、广东、江西、海南、广西和云南共6 个不同省份，样品编号和样品来源见表1。各地区油茶籽经75 ℃烘干、恒重后，使用榨油机180 ℃控温、螺旋压榨成油茶籽油。

表1 油茶籽样品信息表Table 1 Sample information table of Camellia oleifera Abel.

1.2 试剂

石油醚、二甲苯、氢氧化钾、乙醇、正己烷、无水硫酸钠，分析纯，天津大茂化学试剂厂；硫酸，分析纯，广州化学试剂厂；甲醇，色谱纯，Mreda Technology inc，USA。

1.3 主要仪器设备

QP2020 型气相色谱-质谱联用仪（GC-MS），岛津色谱仪器有限公司；SH-Rxi-5Sil MS 毛细管柱，上海安谱实验科技股份有限公司；AR423CN 型分析天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；HWS-26 型电热恒温水浴锅，上海洪纪仪器设备有限公司；BOZY-01G型家用榨油机，乐清市韩皇电器科技有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 碱酯化法

准确称取0.1 g 油样，与2 mL 1:1 二甲苯-石油醚混合溶液充分溶解后，边摇晃边加入4 mL 0.4 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，振摇至溶液澄清后用蒸馏水定容至20 mL。再次振荡混匀，静置分层，取上清液加入几滴无水乙醇使其迅速澄清，加入少许无水硫酸钠后，静置吸取上清液进行GC-MS 分析。

1.4.2 酸酯化法

准确称取0.1 g 油样，加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液，于70 ℃水浴中加热60 min 后取出。再加入2 mL正己烷，并用蒸馏水定容至10 mL，静置分层，取上清进行GC-MS 分析。

1.4.3 GC-MS 分析条件

GC 柱箱温度100 ℃，进样口温度250 ℃，进样方式为分流，进样量1 μL。流量控制方式为压力，压力73.0 kpa，总流量24.0 mL/min，柱流量1.00 mL/min，线速度37.2 cm/sec，吹扫流量3.0 mL/min，分流比20。MS 离子源温度230 ℃、接口温度280 ℃、溶剂延迟时间3 min。总程序时间为45 min，温度先升至100 ℃，保持2 min，然后以10 ℃/min 的速率升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min 的速率升至250 ℃，保持8 min，最后以10 ℃/min 的速率升至280 ℃，保持7 min。

1.4.4 数据处理

检测结果采用GC-MS 分析软件进行分析，脂肪酸甲酯经计算机检索与计算机标准谱图库美国国家标准技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST05）检索对比，结合各种脂肪酸标样保留时间的对比确定脂肪酸的组成，根据面积归一化法计算脂肪酸的相对含量。每个样品三平行。使用SPSS Statistics 17.0 进行方差分析及多重比较，并采用 Excel 2019 软件作图。

2 结果与讨论

2.1 两种甲酯化处理方法对比

分别采用碱酯化法和酸酯化法对茶油样品进行甲酯化处理，经检测分析，获得各脂肪酸的GC-MS 色谱图（见图1）。由图1 可知，两种预处理方法获得的茶油脂肪酸质谱图存在差异。碱法催化效率较高，使得碱甲酯化法检测的GC-MS 色谱响应面积更大，但酸法甲酯化色谱峰重叠较少、脂肪酸检测效果更好，适合脂肪酸含量高的油脂，与刘华鼐等[19]报道相符。其原因可能是，酸酯化法能够检测游离型和甘油三酯型两种脂肪酸，碱酯化法则不适合游离型脂肪酸甲酯的制备[17-18]。本研究采用的两种甲酯化预处理方法获得的茶油脂肪酸含量差异性分析如表2 所示。

表2 两种甲酯化方法处理茶油获得的脂肪酸含量及其差异性分析Table 2 Analysis of contents and significant differences in fatty acids by two methyl esterification methods

图1 两种甲酯化法预处理茶油获得的脂肪酸GC-MS 图Fig.1 GC-MS spectra of fatty acids by two methyl esterification methods

油酸（C18:1）、亚油酸（C18:2）、棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和亚麻酸（C18:3）为茶油主要脂肪酸，两种方法处理后GC-MS 检测到总相对含量均在98%以上。

本研究采用气相色谱-质谱联用技术，酸酯化法处理茶油样品，可检测出辛酸（C8:0）、十三烷酸（C13:0）、肉豆蔻酸（C14:0）等14 种脂肪酸，碱酯化法则多检测出二十二碳酸（C22:0）、二十三碳酸（C23:0）和二十四碳酸（C24:0），比气相色谱法[11-15]检测更多脂肪酸组分。除油酸（C18:1）、芥酸（C22:1）、二十三碳酸（C23:0）和二十四碳烯酸（C24:1），该两种方法预处理检测出的13 种脂肪酸存在显著差异（p＜0.05）。

相同的GC-MS 检测条件下，酸酯化法处理后检测的亚油酸相对含量（10.36%）明显高于碱酯化法（4.77%）。原因可能是，油酸、亚油酸结构相似，且其热不稳定[17]，使得碱酯化法的亚油酸甲酯色谱峰（保留时间20.305 min）受油酸甲酯（保留时间20.943 min）影响（图1），其相对含量误差较大。酸酯化方法可充分甲酯化各脂肪酸，综上所述，检测出的亚油酸色谱峰则相对独立（保留时间20.426 min）。因此，酸酯化法预处理茶油样品更有利于脂肪酸的测定。

2.2 不同地区茶油主要脂肪酸组成及含量分析

比较两种甲酯化法预处理茶油样品后，确定采用酸酯化法对6 个种源地区的茶油样品进行处理，经GC-MS 分析，得出茶油主要脂肪酸的总离子流色谱图（见图2），计算各主要脂肪酸的相对含量并进行差异性分析（见表3）。

由图2 可知，不同产地茶油的脂肪酸组成种类相仿，主要脂肪酸包括肉豆蔻酸（C14:0）、棕榈酸（C16:0）、棕榈烯酸（C16:1）、十七酸（C17:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）、亚油酸（C18:2）、亚麻酸（C18:3）、花生酸（C20:0）、芥酸（22:1）、二十四碳烯酸（24:1）等。

图2 六个地区茶油脂肪酸的GC-MS 代表性总离子流色谱图Fig.2 Total ion current chromatograms of volatile components of Camellia oil from different regions

由表3 可知，不同茶油主要脂肪酸相对含量存在差异（p＜0.05）。六个地区中肉豆蔻酸、十七酸、花生酸、芥酸和二十四碳烯酸相对含量最高的茶油样品均是湖南1，分别为0.10%、0.11%、0.09%、0.17%和0.07%；云南6 茶油的肉豆蔻酸和棕榈酸相对含量则最低，分别为0.05%和11.63%。各地区茶油的十七酸含量差异较小，范围在0.09%～0.11%之间；广西5 茶油棕榈酸含量最高，为12.97%，海南4 茶油的芥酸含量最低，为0.03%；海南4 和广西5 茶油均未检出二十四碳烯酸，其棕榈烯酸含量最低，均为0.08%，海南4 茶油的硬脂酸相对含量最高，为3.74%；广东2茶油的棕榈烯酸含量则最高，为0.12%，硬脂酸的含量则最低，为2.43%。

表3 六个地区茶油主要脂肪酸含量及差异性分析Table 3 Main fatty acids contents and differences analysis of Camellia oil in different regions

海南4 茶油的油酸含量最高，达73.70%，其次为来源于湖南1 的茶油，油酸含量为73.29%±0.10%，江西3 茶油的油酸含量相对最低，为68.67%。广东2 和江西3 两地茶油的亚油酸含量最高，分别为15.21%和15.58%，其他四个地区茶油的亚油酸含量均低于14%，海南4 含量最低，仅为9.29%。除了海南4 地区，亚麻酸在其他五个产地的茶油中均有检出，此检出的亚麻酸为ω-3 不饱和脂肪酸家族中的α-亚麻酸，在体内可转化为DHA、DPA、EPA 等，是影响大脑和脑神经中思维力和记忆力的重要营养成分[20-21]，其中湖南1 茶油亚麻酸含量最高，为0.20%。

由6 个地区的茶油检测平均结果显示（图3a），各类脂肪酸含量由多到少顺序依次为油酸（71.10%）、亚油酸（12.91%）、棕榈酸（12.60%）、硬脂酸（2.86%）、亚麻酸（0.10%）、十七酸（0.10%）、棕榈烯酸（0.09%）、肉豆蔻酸（0.08%）、芥酸（0.08%）、二十四碳烯酸（0.05%）、花生酸（0.04%）和其他脂肪酸（0.03%）。其中油酸作为易被人体吸收的单不饱和脂肪酸，在6 个产地茶油的平均含量高达71.10%，因其具有降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，且能减少心血管疾病风险的功效，被誉为“安全脂肪酸”[22]。亚油酸作为人体必需脂肪酸，是人体合成花生四烯酸的前体物质，在茶油中含量达12.91%。油酸和亚油酸总相对含量达84.01%，是茶油中最主要的两个脂肪酸，因此高含量的油酸和亚油酸常被视为衡量茶油高品质的重要标准。

图3 六个地区茶油各脂肪酸平均含量Fig.3 Average content of each fatty acid of Camellia oil in six regions

由图3b 可知，茶油中84.33%的脂肪酸为不饱和脂肪酸。饱和脂肪酸主要由棕榈酸（12.60%）、硬脂酸（2.86%）、十七酸（0.10%）、肉豆蔻酸（0.08%）、花生酸（0.04%）等组成，相对含量为15.67%，因此棕榈酸是饱和脂肪酸的主要成分。单不饱和脂肪酸主要由油酸（71.10%）、棕榈烯酸（0.09%）、芥酸（0.08%）、二十四碳烯酸（0.05%）等组成，相对含量为71.32%，因此油酸是单不饱和脂肪酸的主要成分。多不饱和脂肪酸主要由亚油酸（12.91%）、亚麻酸（0.10%）组成，相对含量为13.01%，因此亚油酸是多不饱和脂肪酸的主要成分。

2.3 不同地区茶油饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量对比

比较不同地区茶油主要脂肪酸相对含量差异性分析基础上，进一步对比分析不同地区茶油饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和总不饱和脂肪酸的相对含量，结果如图4 所示。

图4 六个地区茶油饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸含量比较Fig.4 Comparison of saturated fatty acids and unsaturated fatty acids of Camellia oil in six regions

由图4 可知，6 个地区茶油中，饱和脂肪酸相对含量最高的地区是海南4 和广西5，分别为16.87%和16.78%，含量最低的地区是云南6，为14.26%。多不饱和脂肪酸相对含量均高于9.00%，范围是9.29%～ 15.67%，最高来自于广东2 和江西3 的茶油样品，最低源自海南4 的茶油样品，符合世界卫生组织（WHO）推荐的保健型营养油脂中人体必需脂肪酸亚油酸等多不饱和脂肪酸含量高于8.0%的要求[23]。单不饱和脂肪酸相对含量最高地区是湖南1 和海南4，分别为73.62%和73.81%，江西3 的茶油样品相对含量最低，为68.91%。总不饱和脂肪酸是茶油脂肪酸的主要成分，相对含量均在83%以上，其中云南6 茶油的脂肪酸不饱和程度最高，达85.74%。

植物油中单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸的比值越高越有利于油脂的稳定[24]，本研究中6 个地区的茶油单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸的比值分别为7:1（湖南1）、5:1（广东2）、4:1（江西3）、8:1（海南4）、5:1（广西5）、5:1（云南6），其中湖南1 和海南4 最高，说明这两个地区的茶油稳定性较好，易于保存。

4 结论

酸酯化和碱酯化预处理油茶籽油样品后，经GC-MS 分析，存在显著性差异，且酸酯化处理更利于茶油脂肪酸的分离检测，本色谱技术结合酯化条件可检测出更多脂肪酸组分。湖南、广东、江西、海南、广西、云南6 个地区茶油不饱和脂肪酸含量均在83%以上，普遍具有优良的品质和较高的营养价值，各脂肪酸含量由高到低依次为油酸＞亚油酸＞棕榈酸＞硬脂酸＞亚麻酸＞十七酸＞棕榈烯酸＞肉豆蔻酸＞芥酸＞二十四碳烯酸＞花生酸，油酸和亚油酸总平均含量高达84.01%。但受地理气候环境等影响，脂肪酸相对含量各有特点和优势。云南茶油的脂肪酸在6 个地区中不饱和程度最高，广东和江西茶油的多不饱和脂肪酸含量较高，湖南和海南茶油稳定性较好。

致谢

本研究诚挚感谢广西壮族自治区林科院油茶所陈国臣所长、云南省林业和草原科学院油茶研究所陈福所长、海南省海口市东山金茂苗木有限公司陈有师董事长、广东省韶关市曲江区国有小坑林场梁瑞友副场长、江西省宜春市袁州区林业（油茶）局李铁明副局长、湖南省攸县卓联种养专业合作社法人代表荣军等提供的油茶样品和大力支持。