白花鬼针草三种提取液成分预试及其抗氧化和抗菌活性研究

纪 璇，周光现，袁裕珊，黎嘉杰，阳 帆，林红英，陈进军，陈志宝，康丹菊

(广东海洋大学 滨海农业学院，广东 湛江 524088)

白花鬼针草[Bidensalba(L.) DC]为菊科鬼针草属一年或多年生草本植物，原产于美洲，在中国广东省广泛分布，尤其在湛江、阳江、茂名等粤西地区，其繁殖能力强，侵占速度快，能通过释放感化物质来抑制其它植物生长，对当地农林生产及生态系统造成严重影响[1-3]。研究表明白花鬼针草具有广泛的药用价值。目前，国内外对鬼针草属植物的研究多集中于婆婆针和三叶鬼针草，而对白花鬼针草的报道相对较少[4-6]，且主要关注其作为入侵杂草破坏生态系统，而关于其在药理应用方面的研究较少。袁明贵等指出白花鬼针草含有黄酮类化学成分，其乙醇提取物具有抗炎作用[7]，且白花鬼针草全草经有机溶剂萃取后可制备成具有镇痛作用的药物[8-9]。白花鬼针草乙醇提取物的乙酸乙酯部位具有抗癌活性[10]。此外，白花鬼针草还可以促进动物生长[11]。本文研究白花鬼针草水提物、80%甲醇提取物和50%乙醇提取物的体外抗氧化和抗菌活性，旨在为白花鬼针草的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白花鬼针草采自广东海洋大学校园，由广东海洋大学植物分类学教授吴钿鉴定。ABTS购自合肥博美生物公司，DPPH购自福州飞净生物科技有限公司，芦丁标准品购自西安天宝生物科技有限公司，10%α-萘酚乙醇、10%NaOH、10%CuSO4、10%盐酸、茚三酮、1%FeCl3、2%FeCl3、5%FeCl3、10%KOH、10%硫酸亚铁、1%铁氰化钾、0.1%溴酚蓝的70%乙醇溶液、1%醋酸镁甲醇溶液、碘化铋钾、碘-碘化钾、硅钨酸、碱性苦味酸、间二硝基苯、重氮盐、10%甲醛、EDTA-Na2、5%NaNO2、10%Al(NO3)3、4%NaOH、6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、6 mmol/L H2O2、2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等均自行配制，试验所用常规药品与试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

主要仪器有HK-860W水冷式中药粉碎机(广州市旭朗机械设备有限公司)，SB-5200超声波振荡仪(宁波新芝仪器研究所)，RE-52旋转蒸发仪(上海沪西仪器厂)，V-1000分光光度计(翱艺仪器(上海)有限公司)，SHZ-Ⅱ循环水多用真空泵(河南巩义市英峪予华仪器厂)，LRH-150B生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)等。

1.3 菌种与培养基

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichiacoli)由广东海洋大学兽医微生物教研室提供。LB营养肉汤及营养琼脂购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.4 试验方法

1.4.1 白花鬼针草3种提取物的制备 洗净白花鬼针草表面杂质，阴干后剪成3～5 cm小段，取适量干燥样品粉碎，过60目筛制得粗粉备用。提取方法参考文献[12-13]，结合预试验结果加以改良：(1)取10 g白花鬼针草粗粉，按1∶20料液比加入蒸馏水，60 ℃超声浸提60 min，浸提液经冷却、过滤、离心、浓缩至10 mL，制成浓度为1 g/mL的水提取液，置于4 ℃冰箱中保存；(2)取10 g白花鬼针草粗粉，按1∶30加入50%的乙醇溶液(体积分数)，60 ℃超声浸提30 min，后续步骤同(1)，获得乙醇提取物；(3)取10 g白花鬼针草粗粉，按1∶5加入80%的甲醇溶液(体积分数)，25 ℃超声浸提15 min，后续步骤同⑴，获得甲醇提取物。

1.4.2 白花鬼针草3种提取物成分预试验 参考文献[14]方法，取上述3种提取液，选择各类成分特有的化学反应进行重复试验，根据颜色反应、沉淀反应等进行结果判定(表1)。

表1 白花鬼针草提取液成分预试及检测方法Table 1 Pre-test and detection method of extracts from Bidens alba ( L.) DC

1.4.3 总黄酮含量的测定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法[12-13]来测定白花鬼针草水提取液、50%乙醇提取液和80%甲醇提取液中总黄酮含量。(1)绘制标准曲线：精密称取芦丁对照品10.0 mg，用70%乙醇超声溶解并定容至100 mL容量瓶中，制得浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准液。分别取芦丁标准液0、1、2、3、4、5、6 mL于10 mL离心管中，加入70%乙醇至6 mL，加入0.3 mL质量分数为5%的NaNO2溶液并摇匀，静置反应6 min；再加入0.3 mL质量分数为10%的Al(NO3)3溶液并摇匀，静置反应6 min；最后加入2 mL质量分数为4%的NaOH溶液，混匀反应15 min，以70%乙醇补足体积至10 mL，于510 nm波长处测定其吸光度，空白试剂为参比液。(2)总黄酮含量测定：分别量取5 mL提取液，依次加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液和0.3 mL 10%的Al(NO3)3溶液，摇匀静置6 min，加入2 mL 4%的NaOH溶液并摇匀，以70%乙醇补足至10 mL，摇匀并静置15 min，于510 nm处测吸光度，重复3次取平均值作为测量值，按照以下公式计算，所得数据即为提取液中总黄酮含量。

总黄酮含量(mg/g)=c×v/m

式中：c为每毫升样品中测得的总黄酮含量(mg/mL)，v为提取液的总体积(mL)，m为配制提取液所量取的样品质量(g)。

1.4.4 清除羟基自由基能力的测定 采用文献[15]方法测定提取物对羟基自由基的清除率。量取2 mL待测液，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液2 mL、6 mmol/L H2O2溶液2 mL，37 ℃反应30 min后于510 nm波长处测定溶液吸光度A0。按相同方法配制无待测液的反应溶液并于510 nm波长处测定吸光度A1，配制无H2O2的反应溶液并于510 nm处测定其吸光度A2。空白对照以蒸馏水代替提取液。

羟基自由基清除率=A1-(A0-A2)/A1×100%

式中：A0为含有待测提取液的溶液的吸光度；A1为未加入待测提取液的溶液即空白对照液的吸光度；A2为无显色剂H2O2溶液的待测提取液本底的吸光度。

1.4.5 清除DPPH自由基能力的测定 根据文献[16]方法测定DPPH清除能力。称取3.4 mg DPPH加入无水乙醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，制得0.2 mmol/L储备液，冷藏待用。取一带塞试管，加入2 mL待测液和2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，以无水乙醇补足，使反应溶液总体积达到5 mL，混匀后在避光处反应30 min，于517 nm波长处测其吸光度。

DPPH清除率=(C0-C1+C2)/C0×100%

式中：C0为按以上方法配制用无水乙醇代替提取液的溶液的吸光度；C1为按以上方法含有待测提取液和DPPH储备液的溶液的吸光度；C2为按以上方法配制用无水乙醇代替DPPH储备液的溶液的吸光度。

1.4.6 清除ABTS自由基能力的测定 方法参照文献[17]。精确配制7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液，并将二者等体积混匀，将混合溶液于室温避光的环境下反应12～16 h，所得溶液即为ABTS储备液，避光保存。取ABTS储备液用无水乙醇稀释，制成工作液，要求ABTS工作液在30 ℃且波长为734 nm的条件下所测得的吸光度为D0=0.7±0.02，现配现用。精密量取1 mL提取液与2 mL ABTS工作液混匀，将混合液于734 nm处检测其吸光度D1。

ABTS自由基清除率=D0-D1/D0×100%

式中：D0为ABTS工作液在734 nm下所测得的吸光度；D1为含有待测提取液和ABTS工作液的按以上方法所测得的吸光度。

1.4.7 3种提取液的抗氧化能力对比 按照1.4.3所述方法可知对照品在浓度为0～60 mg/L范围内浓度与其总黄酮含量呈线性关系，在排除试剂颜色干扰的情况下，使用提取液原液及其所配制成的不同浓度的提取液，分别测其羟基自由基清除率、DPPH清除率、ABTS清除率，以相同质量浓度的Vc溶液为阳性对照，将3种提取母液及其不同浓度的提取液所对应的羟基自由基清除率绘制成曲线并进行比较。使用Microsoft Excel2013和SPSS 20.0软件整理与分析所得数据。

1.4.8 体外抗菌活性测定 配制浓度为0.5 g/mL的水提取液、50%的乙醇提取液和80%的甲醇提取液。采用二倍稀释法，设置阳性对照和阴性对照，分别用水提取物、乙醇提取物和甲醇提取物对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌进行抑菌效果检测，通过测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)来确定各提取物的抗菌活性。

2 结果与分析

2.1 白花鬼针草3种提取物成分预试

化学成分预试结果见表2。结果表明，白花鬼针草水提液中可能含有糖类、多糖、还原糖、氨基酸、多肽或蛋白质、多肽或蛋白质、鞣质类、皂苷、黄酮类、蒽醌类化合物、甾体和三萜类、生物碱类、香豆素、内酯类物质；甲醇提取液中可能含有还原糖、鞣质类、有机酸、黄酮类、蒽醌类化合物、甾体和三萜类、香豆素、内酯类成分；乙醇提取液中可能含有还原糖、氨基酸、多肽或蛋白质、酚类、鞣质类、有机酸类、黄酮类、蒽醌类化合物、生物碱类、强心苷类香豆素、内酯类成分。

表2 白花鬼针草3种提取物化学成分预试结果Table 2 The preliminary test results of extracts from Bidens alba ( L.) DC

2.2 白花鬼针草3种提取物的总黄酮含量

2.2.1 芦丁标准曲线 按照1.4.3所述方法获得数据并经统计处理后绘制芦丁标准曲线(图1)，其回归方程为y=9.9679x-0.0053(R2=0.999)，对照品在0～60 mg/L范围内呈线性关系。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

2.2.2 提取物中总黄酮含量 按照1.4.1和1.4.3所述方法获得的白花鬼针草水、乙醇、甲醇3种提取物中总黄酮含量结果见表3。从表3可以看出，在最适条件下，白花鬼针草的水、乙醇和甲醇提取物的总黄酮提取率由高到低依次为乙醇>水>甲醇。

表3 不同提取物中总黄酮含量比较Table 3 Comparison of total flavonoids content in different extracts

2.3 白花鬼针草3种提取物的体外抗氧化能力

2.3.1 清除羟基自由基的能力 使用浓度为0.06 g/mL的提取液及其稀释2、4、8、16和32倍的溶液(样品浓度分别为60、30、15、7.5、3.75和1.875 mg/mL)测定羟基自由基清除能力，结果见图2。浓度在7.5 mg/mL以上时，3种提取物的羟基自由基清除能力随着浓度增加而提高，乙醇、水提取物羟基自由基清除水平差异较小，但均明显强于甲醇提取液；3种提取液之间羟基自由基清除能力差异随着提取液浓度减小而呈缩小的趋势，提取液浓度为60 mg/mL时，水、乙醇和甲醇提取液的还原力分别为88.56%、94.41%和37.46%；提取液浓度为30 mg/mL时3种提取液间的还原力差异最大，依次为水提液83.33%、乙醇提取液68.79%、甲醇提取液14.18%。由此可推测，水提液和乙醇提取液中所含抗氧化物质的含量相对较多，在一定浓度范围内甲醇提取液的抗氧化性受溶液稀释度的影响相对较小。

图2 3种提取液及Vc的羟基自由基清除能力Fig. 2 The hydroxyl radical scavenging abilityof three extracts and VC

2.3.2 清除DPPH自由基的能力 使用浓度为0.03 g/mL的提取液及其稀释2、4、8、16倍的溶液(样品浓度分别为30、15、7.5、3.75、1.875 mg/mL)测定DPPH自由基清除能力，结果见图3。当提取液浓度在3.75～30 mg/mL时，乙醇提取液和甲醇

图3 3种提取液及Vc的DPPH自由基清除能力Fig. 3 DPPH free radical scavenging ability ofthree extracts and VC

提取液的DPPH清除能力保持在80%以上，DPPH清除能力较强，且受溶液浓度变化的影响较小，而水提取液的DPPH清除能力则随浓度的减小而明显减弱，二者与水提取液的DPPH自由基清除能力在溶液稀释至3.75 mg/mL时差异最大，水提取液的DPPH清除能力此时最弱；浓度为7.5 mg/mL时，甲醇提取液的DPPH清除能力明显开始下降，水提取液、乙醇提取液的DPPH自由基清除水平则无明显变化。由此可以推测，乙醇提取液和甲醇提取液中所含抗氧化物质的含量相对较多，且在一定浓度范围内二者的抗氧化性受溶液稀释度的影响相对较小。

2.3.3 清除ABTS自由基的能力 使用浓度为0.06 g/mL的提取液及其稀释2、4、8、16和32倍的溶液(样品浓度分别为60、30、15、7.5、3.75、1.875 mg/mL)测定ABTS自由基清除能力，结果见图4。相同质量浓度时，乙醇提取液和甲醇提取液的ABTS自由基清除水平高于水提取液，且三者的ABTS自由基清除能力均随着浓度减小而呈下降趋势。当浓度达到60 mg/mL以上时，3种提取液的ABTS自由基清除能力趋于稳定，无明显差异，清除率近乎达100%；当提取液浓度下降到15 mg/mL时，水提取液的ABTS自由基清除率开始明显降低，而甲醇提取液和乙醇提取液的清除率仍保持在100%左右；当提取液稀释到3.75 mg/ mL时，甲醇提取液和乙醇提取液的ABTS自由基清除率开始明显下降，但二者的清除率仍高于80%。由此可以推测，甲醇提取液和乙醇提取液中所含抗氧化物质的含量相对较多，且在一定浓度范围内其抗氧化性受溶液稀释度的影响相对较小。

图4 3种提取液及Vc的ABTS自由基清除能力Fig. 4 ABTS free radical scavenging ability of three extracts and VC

2.4 白花鬼针草3种提取物的体外抑菌活性

2.4.1 最小抑菌浓度(MIC) 白花鬼针草各提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌及沙门氏菌的最低抑菌质量浓度见表4。白花鬼针草的3种提取物中，抗菌作用最弱的是水提取物，最强的是甲醇提取物，当其质量浓度分别大于或等于62.5、31.25、62.5和15.625 mg/mL时，无金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌和沙门氏菌生长。

表4 白花鬼针草提取物对4种细菌的最低抑菌浓度Table 4 The MIC of extracts from Bidens alba ( L.) DC against the four bacteria

2.4.2 最小杀菌浓度(MBC) 白花鬼针草各提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌及沙门氏菌的最低杀菌质量浓度见表5。白花鬼针草3种提取物中，乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和沙门氏菌的杀菌效果最好，其MBC均为125 mg/mL；3种提取物对大肠杆菌的杀菌效果均较弱。

表5 白花鬼针草提取物对4种细菌的最小杀菌浓度Table 5 The MBC of extracts from Bidens alba (L.) DC against the four bacteria mg/mL

3 讨 论

3.1 白花鬼针草3种提取物化学成分

陈君等采用系统预试法对白花鬼针草进行了化学成分预试，表明白花鬼针草中可能含有黄酮类、蒽醌类和挥发油等化学成分[18]，并从白花鬼针草中首次分离鉴定出木栓酮、正十三烷、木栓醇、β-谷甾醇、21a-羟基木栓烷-3-酮、豆甾醇、羽扇豆醇、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、二十烷酸和木栓烷-3β-醇-27-酸物质[14]。董丽等[19]发现白花鬼针草的挥发油中同样含活性成分或具有协同作用的成分，如蒎烯、萜品醇、龙脑等。本试验结果亦表明，白花鬼针草全草中含有糖和苷类、氨基酸、多肽或蛋白质、酚类、鞣质类、黄酮类、蒽醌类化合物、甾体和三萜类、强心苷类、香豆素、内酯类、生物碱类和挥发油等化学成分。此外，曹利民等[20]还发现白花鬼针草富含Vitamin C，且其中谷氨酸、天门冬氨酸、VB1、VB2含量较为丰富。无论从保健角度还是营养价值上来看，白花鬼针草都有广泛的应用前景。

3.2 白花鬼针草3种提取物的抗氧化活性

据报道，黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、抗癌等多种药理活性和作用[21]。本试验结果也显示白花鬼针草含有丰富的黄酮类化合物。目前，国内外提取总黄酮最常见的方法即是基于相似相溶原理的有机溶剂萃取法，本试验在前人研究[22-23]的基础上选择当地来源广泛的南药资源白花鬼针草为试验材料，以常用的有机溶剂甲醇、乙醇和水为提取剂，采用超声波浸提法，通过预试验得到3种溶剂作为提取剂时的最适提取条件，以水、50%乙醇和80%甲醇对白花鬼针草中总黄酮进行粗提取，并对各提取剂所获得的黄酮提取率及提取效果进行比较。结果表明，3种提取剂对白花鬼针草提取总黄酮的效率有明显差异，这与不同有机溶剂提取高粱米中的提取物结果一致[24]。在最适条件下，乙醇提取液中总黄酮的含量最高，为13.34 mg/g；其次是水提取液，为8.10 mg/g；甲醇提取液所含黄酮含量最低，为2.44 mg/g。

本研究显示，不同提取剂所提取出的白花鬼针草中总黄酮类物质对ABTS、DPPH、羟基自由基具有一定的清除能力，与此前已有的研究结果相符[16,25]。由不同提取剂所提取出的白花鬼针草中总黄酮类物质的抗氧化活性有明显差异，这与所获得活性物质的含量有关。总黄酮含量越高，其抗氧化活性越强[26]。孙霁寒等[27]、刘曦等[28]的研究表明豆腐柴和蓝莓叶提取物的抗氧化活性和总黄酮含量有关。本试验以Vc为阳性对照，比较白花鬼针草的水提取液、50%乙醇提取液和80%甲醇提取液在DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和羟基清除能力3个方面的抗氧化性能。就整体而言，对羟基自由基清除能力强弱顺序为Vc溶液>乙醇提取液≈水提取液>甲醇提取液；对DPPH自由基清除能力强弱顺序为Vc溶液提取液>乙醇提取液≈甲醇提取液>水提取液；对ABTS自由基清除能力强弱顺序为Vc溶液提取液>乙醇提取液≈甲醇提取液>水提取液。可见，本试验中在DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力两个方面，乙醇提取液和甲醇提取液所表现出的抗氧化性能较强，且随着浓度降低二者保持抗氧化性的能力也较强，水提取液在这两个方面的抗氧化性能表现相对最差。而在羟基自由基清除能力上，乙醇提取液和水提取液所表现出的抗氧化能力较强。

3.3 白花鬼针草3种提取物的体外抑菌活性

试验结果表明，白花鬼针草水提液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌和沙门氏菌的抑菌与杀菌效果均最差；而其甲醇提取物的抑菌效果最好，且其对革兰氏阴性菌的抑制作用优于对革兰氏阳性菌的抑制作用，其中甲醇提取物对沙门氏菌的抑菌效果最好，MIC为15.625 mg/mL，MBC为250 mg/mL；乙醇提取物的杀菌效果最好，且其对金黄色葡萄球菌(MIC为125 mg/mL，MBC为125 mg/mL)、沙门氏菌(MIC为62.5 mg/mL，MBC为125 mg/mL)和蜡状芽孢杆菌(MIC为125 mg/mL，MBC为125 mg/mL)的杀菌效果均较好。

本试验所选用的供试菌种类涵盖范围较广，既有革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌，还有带芽孢杆菌，由此可见白花鬼针草提取物的抗菌谱较广泛，这也为白花鬼针草抗菌消炎的作用提供了参考依据，故其作为抗菌消炎药大有发展前景。

4 结 论

本研究结果表明，白花鬼针草水、乙醇、甲醇3种提取物含有多糖、还原糖等成分，且具有明显的黄酮类化合物特性，其不同提取液中总黄酮含量和抗氧化活性差异明显且有一定的剂量-效应关系。白花鬼针草的50%乙醇提取物在这3种提取物中总黄酮含量最高且抗氧化性能及杀菌活性表现最好，其甲醇提取物则抑菌活性最好。