绒山羊胎儿皮肤组织中miR-199a-5p的表达特征及其靶基因研究

张彤彤，王 蒙，郑玉杰，杜佳勉，王 昕

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

羊绒是山羊皮肤次级毛囊产生的无髓纤维[1]，影响羊绒产量和品质的因素很多，其中次级毛囊数量和特性对羊绒生产具有重要影响。毛囊的发生起始于胚胎期，期间依赖于表皮和真皮间充质细胞间的相互作用，可分为诱导、结构形成与分化3个阶段[2]。已有的研究表明，陕北白绒山羊毛囊在胚胎期65 d(E65)处于诱导阶段，胚胎期120 d(E120)处于分化阶段[3]。毛囊发生发育过程是众多基因时空表达的过程，不仅受到信号、转录因子和表观遗传的调节[4-5]，还受到microRNA (miRNA)的调控[6-8]。

MiRNA是一类内生的、长度约为20～24 nt的小RNA，其种子序列通过与靶mRNA的3' UTR区结合，导致靶mRNA的降解或翻译起始的抑制，进而调控基因的表达[9]。近年来的大量研究表明， miRNA 参与毛囊的发生及周期性发育过程，如miR-140-5p[10]、miR-26a[11]和miR-29a[12]等。

课题组前期对陕北白绒山羊E65和E120的皮肤样品进行miRNA测序，得到许多差异表达的miRNA，包括miR-199a-5p。已有研究表明，miR-199a-5p靶向调控cyclinB1促进小鼠角质细胞增殖[13]。由此推测，miR-199a-5p可能参与调控陕北白绒山羊毛囊的发生发育。为了进一步研究miR-199a-5p在陕北白绒山羊毛囊发生发育过程中的作用，本研究利用生物信息学方法对miR-199a-5p进行同源性分析及靶基因预测。通过双荧光素酶报告系统和qPCR验证miR-199a-5p与靶基因的靶向关系，为进一步研究陕北白绒山羊毛囊发生发育过程中miR-199a-5p调控作用的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 皮肤样品、细胞和质粒

试验用羊来自于陕西省榆林学院陕北白绒山羊工程技术研究中心。选择6只2岁左右、体重基本相同的妊娠母羊，手术法采集胚胎期65 d和120 d的胎儿皮肤组织，将组织浸润到RNA/DNA保护液中，-80 ℃低温保存。毛乳头细胞为新分离的陕北绒山羊原代细胞， HEK293T细胞和psiCHECK-2载体均系本实验室保存。

1.2 miR-199a-5p序列保守性分析

从miRBase中检索人(Homosapiens, hsa)、小鼠(Musmusculus, mmu)、大鼠(Rattusnorvegicus, rno)、山羊(Caprahircus, chi)、鸡(Gallusgallus, gga)、马(Equuscaballus, eca)、婆罗州猩猩(Pongopygmaeus, ppy)、黑猩猩(Pantroglodytes, ptr)、大猩猩(Gorillagorilla, ggo)、猕猴(Macacamulatta, mml)和猪(Susscrofa, ssc)等的miR-199a-5p序列，分析其保守性。

1.3 miR-199a-5p的靶基因预测

将TargetScan7.0 ( http://www.targetscan.org /vert _ 71 /)、PicTar ( http://pictar.mdcberlin.de /)和miRanda ( http://www.microrna.org /microrna/getDownloads.do)预测的miR-199a-5p的靶基因取交集，结合课题组前期转录组测序结果以及文献报道，初步确定miR-199a-5p的靶基因为JUNB。

1.4 引物的设计与合成

参照Chen等的方法设计miR-199a-5p茎环结构反转录引物，利用Primer Premier 6.0软件设计miR-199a-5p、U6、JUNB和β-actin的qPCR引物，引物序列详见表1。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

1.5 细胞转染

HEK293T细胞和毛乳头细胞复苏后接种于培养皿中，待细胞长满后用胰酶消化，然后分别用含10% FBS 的 DMEM和DMEM-F12培养基重悬细胞，后接种于6孔板。待细胞密度达到约70%～80%时，按照Lipofectamine 2000说明书转染miR-199a-5p mimics /mimics NC和inhibitor/inhibitor NC至细胞。试验共设4个组，每组3个重复，48 h后收集细胞，提取RNA。根据miRBase数据库得到miR-199a-5p的成熟体序列，由上海吉玛制药技术有限公司设计合成miR-199a-5p mimic /mimics NC和inhibitor/inhibitor NC，序列信息详见表2。

表2 miR-199a-5p相关序列信息Table 2 Information of miR-199a-5p related sequence

1.6 实时荧光定量PCR

采用Trizol法提取皮肤和细胞总RNA后，将RNA稀释到同一浓度，按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒说明书反转录合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(TaKaRa)进行实时荧光定量PCR(qPCR)，每个样本重复3次。 qPCR反应体系为15 μL：cDNA 1.2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，2×SYBR Ex Taq Ⅱ 7.5 μL，ddH2O补足体系。qPCR反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。分别以U6和β-actin为内参计算miRNA和mRNA的相对表达量。使用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量，通过GraphPad Prism 7.0软件的t-test检验分析数据并作图。

1.7 载体构建

以绒山羊皮肤组织DNA为模板，PCR扩增miR-199a-5p靶基因JUNB3' UTR序列，设计引物如下，F:CCCTCGAGGACCTGAGGGCGCAACAAAC；R：ATTTGCGGCCGCTCCACAGTACGGTGCAGAGG。将扩增产物胶回收后和psiCHECK2质粒使用XhoⅠ和NotⅠ内切酶进行酶切，将扩增片段连接到psiCHECK2质粒上，构建重组质粒。

1.8 双荧光素酶报告系统

HEK293T细胞复苏后接种于培养皿中，待细胞长满后用胰酶消化，然后用含10% FBS 的 DMEM培养基重悬细胞后接种于48孔板。待细胞密度达到约70%～80%时，按照 Lipofectamine 2000说明书将miR-199a-5p mimics /mimics NC和inhibitor/inhibitor NC分别与JUNB3' UTR重组质粒两两共转染至细胞。共设4个试验组，每组3个重复。按照Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega)试剂盒说明书进行细胞裂解和双荧光素酶活性检测。

1.9 数据分析

通过SPSS统计分析软件对基因表达水平进行差异显著性检验，组间比较采用独立样本t检验法，后利用GraphPad Prism 7.0软件进行作图。结果以平均值±标准误表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 miR-199a-5p在绒山羊胎儿皮肤组织中的表达

通过qPCR技术检测miR-199a-5p在绒山羊毛囊发生过程中不同阶段的表达情况，结果表明miR-199a-5p在E65(诱导阶段)高表达，E120(分化阶段)低表达(P<0.05)(图1)。

图1 miR-199a-5p在绒山羊胚胎期65 d和120 d皮肤组织中的表达情况* 表示P<0.05, **表示P<0.01。下图同Fig. 1 Expression of miR-199a-5p in the skin tissuesof cashmere goat embryos at 65 d and 120 d* indicate significant difference(P<0.05), ** indicatehighly significant difference(P<0.01). The same below

2.2 miR-199a-5p保守性分析

从表3中人、小鼠、大鼠、山羊、鸡、马、婆罗州猩猩、黑猩猩、大猩猩、猕猴和猪等物种的miR-199a-5p序列可以看出，miR-199a-5p在进化中非常保守，成熟体序列完全一致。

表3 不同物种的miR-199a-5p序列Table 3 Sequence of miR-199a-5p from different species

2.3 miR-199a-5p靶基因的预测和分析

利用TargetScan、PicTar和miRanda预测miR-199a-5p的靶基因，取三者的交集共有151个基因(图2A)，合并已研究证实的60个靶基因[14-21](表4)，共获得193个基因。将靶基因集合与课题组胚胎期转录组测序数据联合分析[3]，取交集获得88个靶基因(图2B)。GO富集分析发现靶基因主要富集在细胞组分、细胞进程和大分子结合等过程(图3)，而 KEGG pathway富集分析发现这些靶基因主要富集在调节干细胞多能性、TNF及MAPK等通路上(图4)。

图2 miR-199a-5p靶基因预测情况A. 3种软件预测miR-199a-5p的靶基因结果；B. 靶基因集合与转录组测序结果的联合分析结果Fig. 2 Prediction of miR-199a-5p target genesA. Prediction results of miR-199a-5p target genes using 3 kinds of bioinformatics tools;B. Combined analysis of target gene set and transcriptome sequencing results

图3 miR-199a-5p靶基因的GO富集分析结果Fig. 3 GO enrichment analysis results of miR-199a-5p target genes

图4 miR-199a-5p靶基因的KEGG pathway分析结果Fig. 4 KEGG pathway enrichment analysis results of miR-199a-5p target genes

表4 研究证实的miR-199a-5p靶基因统计Table 4 Statistics of research confirmed miR-199a-5p target gene

2.4 miR-199a-5p过表达和抑制效果检测

将miR-199a-5p mimics /mimics NC和inhibitor/inhibitor NC转染HEK293T细胞，转染48 h后利用qPCR技术检测，结果表明，mimics组与mimics NC组相比，miR-199a-5p的表达量极显著升高(P<0.01)；inhibitor组与inhibitor NC组相比，miR-199a-5p的表达量显著降低(P<0.05)(图5)。

图5 转染mimics/mimics NC和inhibitor/inhibitorNC后miR-199a-5p的表达情况Fig. 5 Expression of miR-199a-5p after transfection withmimics/mimics NC and inhibitor/inhibitor NC

2.5 双荧光素酶试验验证miR-199a-5p与JUNB的靶向关系

由于转录因子JUNB在毛囊分化过程中起重要作用[3,22]，因此将JUNB基因作为候选靶基因进一步研究。TargetScan分析表明，JUNB基因的3' UTR包含miR-199a-5p的结合位点(图6A)，PCR扩增JUNB基因3' UTR片段，长度为296 bp(图6B)。将扩增的JUNB基因3' UTR片段克隆至psiCHECK2载体上，构建psiCHECK2-JUNB3' UTR重组载体。经测序验证(图6C)，双荧光素酶报告载体构建成功。

图6 psiCHECK2-JUNB 3' UTR载体构建A. miR-199a-5p与JUNB 3' UTR的结合位点；B. PCR扩增JUNB 3' UTR片段；C, psiCHECK2-JUNB 3' UTR载体测序结果M. DL5000 DNA Marker; 1. 绒山羊皮肤DNA的PCR产物；图6C中颜色标记部分为PCR扩增JUNB基因3' UTR片段序列Fig. 6 psiCHECK2-JUNB 3'UTR vector constructionA. The binding site of miR-199a-5p and JUNB 3' UTR;B. PCR amplification of the JUNB 3' UTR fragment;C. psiCHECK2-JUNB 3' UTR vector sequencing resultsM. DL5000 DNA Marker; 1. PCR product from skin DNA of cashmere goat；fig. 6C, color labeled sequence of JUNB gene 3' UTR amplified by PCR

将psiCHECK2-JUNB3' UTR重组载体和miR-199a-5p mimics/mimics NC/inhibitor/inhibitor NC分别共转染HEK293T细胞，每组设置3个重复，转染48 h后按照双荧光素酶报告系统试剂盒说明书进行细胞裂解和双荧光素酶活性检测。结果表明，miR-199a-5p-mimics+JUNB3' UTR共转染组与对照组相比，荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；miR-199a-5p inhibitor +JUNB3' UTR共转染组与对照组相比，荧光素酶活性显著升高(P<0.05)，表明JUNB基因的3' UTR存在miR-199a-5p的结合位点，JUNB基因是miR-199a-5p的潜在靶基因(图7)。

图7 双荧光素酶试验检测miR-199a-5p与JUNB 3'UTR的关系Fig. 7 The dual luciferase assay detected the relationshipbetween miR-199a-5p and JUNB 3' UTR

2.6 miR-199a-5p抑制JUNB的表达

将miR-199a-5p mimics /mimics NC和inhibitor/inhibitor NC转染至毛乳头细胞中，通过qPCR检测靶基因JUNB的表达量。结果表明，mimics组与mimics NC组相比，JUNB的表达量极显著下降(P<0.01)；inhibitor组与inhibitor NC组相比，JUNB的表达量显著升高(P<0.05)，即miR-199a-5p抑制JUNB基因的表达(图8)。

3 讨 论

毛囊是皮肤组织重要的附属可再生器官，控制着动物毛发的生长、品质和产量[23]。毛囊发生始于早期的胚胎阶段，表皮与真皮间充质细胞之间相互作用，期间毛囊形态学变化较为复杂，可分为诱导、结构形成和分化3个阶段[2]。已有研究表明，miRNA在毛囊发生发育过程中起关键作用。miR-30b-5p通过靶向CaMKIIδ抑制毛乳头细胞的增殖，进而参与绒山羊毛囊发育[24]。miR-218-5p通过靶向SFRP2增强Wnt信号通路活性，并在皮肤和毛囊发育过程中发挥动态调控作用[25]。miR-148a和miR-10a抑制真皮乳头细胞增殖，并且靶向调控BMP7基因[26]。

研究表明，在人类皮肤鳞状细胞癌中，miR-199a-5p 过表达可抑制皮肤角质形成细胞的增殖，并下调靶基因Bcam、Fzd6和Ddr1的表达[27]。但miR-199a-5p的研究大多集中于人和小鼠，在山羊上的研究较少。课题组前期对陕北白绒山羊胚胎期皮肤组织进行了miRNA测序，发现miR-199a-5p在胚胎期65 d的表达量较高，在120 d的表达量较低。本研究利用qPCR技术检测miR-199a-5p在陕北白绒山羊胎儿皮肤组织中的表达情况，结果与测序结果相一致，提示miR-199a-5p可能在毛囊发生发育过程中起重要作用。通过对多个物种间miR-199a-5p序列进行对比，发现miR-199a-5p在多个物种中序列高度保守，提示其可能在山羊上具有重要的生物学功能。

miRNA通常与靶基因mRNA 3′UTR结合，以负调控的方式作用于靶基因，继而发挥其调控作用[28]。本研究对miR-199a-5p的靶基因进行预测和筛选，并进行功能富集分析，发现其靶基因显著富集于调控干细胞多能性、TNF及MAPK信号通路等。TNF家族参与毛囊的发生发育，其家族成员Eda及其受体Edar发挥主要调控作用，诱导毛囊发生并维持基板结构[29]，推测miR-199a-5p可能通过调控TNF信号通路相关基因的表达影响毛囊的发生。MAPK信号通路在细胞增殖、分化和迁移等多种生理学过程中发挥调控作用，且在真核生物中高度保守[30]。有研究发现MAPK信号通路在毛囊干细胞的自我更新中起重要作用[31]，推测miR-199a-5p能够通过调控MAPK信号通路参与毛囊的生长发育。

转录因子JUNB是二聚体转录因子AP-1(activator protein-1, 激活蛋白-1)家族的成员，是构成转录激活蛋白 AP-1的重要亚基。已有研究表明糖皮质激素受体在多种细胞类型(包括角质形成细胞)中与转录因子JUNB结合并抑制其表达，能够显著影响毛囊的发育[22]。本研究以JUNB基因作为miR-199a-5p的潜在靶标，研究miR-199a-5p在毛囊分化过程中的重要作用，发现miR-199a-5p能够靶向下调JUNB的表达，提示miR-199a-5p可能通过调控JUNB的表达参与毛囊的分化。但miR-199a-5p在毛囊发生发育中的功能尚不清楚，有待研究。

4 结 论

本研究利用qPCR技术检测到miR-199a-5p在绒山羊毛囊发生不同阶段中差异表达，并通过生物信息学对miR-199a-5p的靶基因进行预测和分析。从中筛选并鉴定JUNB基因是miR-199a-5p的靶基因。这些结果为进一步研究miR-199a-5p调控陕北白绒山羊毛囊发生发育奠定基础。