始丰微型牛体型与外周血GH/GHR、IGF-1水平关联性研究

印陆仪，冀德君，王涵哲, 张 威

(扬州大学 动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009)

始丰微型牛是中国浙江省地方保护品种天台黄牛的一个微型类群。天台黄牛分布在浙江省台州市天台县，属肉役兼用型的地方优良品种。历史上天台县山区交通不便，耕地水利条件差，山区梯田重叠，山块小，土层浅，本地黄牛耐粗抗热，行动灵敏，对地形复杂的山地梯田耕作适应能力强，便于放牧饲养，且肉质鲜嫩，经过长期自然选择和人工选育而形成了一个当地黄牛品种。在天台黄牛群体中，按1.5岁公牛体高低于95 cm，母牛低于90 cm的标准划分，存在着一定比例的微小体型个体，经过十余年的分群管理和微小体型定向选育，逐步形成了一个微小体型类群——始丰微型牛[1]。

中国南方黄牛较北方黄牛普遍体型较小，身躯与头部表现为窄型。黄牛体型大小的形成与遗传特性、生长激素和性激素轴的调控有关[2]。生长激素轴主要通过由垂体前叶嗜酸性粒细胞合成和分泌的生长激素(GH)来调控动物生长发育及相关代谢过程；GH可直接诱导肝脏产生IGF-1，同时GH和其受体结合可促进由复合酸不稳定亚基(ALS)和类胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)组成三元IGF复合体，从而稳定血液中的IGF-1水平[3]。IGF-1参与身体的营养代谢，具有增加DNA和蛋白质合成，促进葡萄糖和氨基酸吸收的功能[4]，其水平与体重增加呈正相关。外源性 IGF-1 能够介导GH发挥促生长的生理作用[5]。矮小动物相关研究中，IGF-1基因在伴性矮小型鸡肝脏中的表达量远远低于普通鸡，在伴性矮小型鸡肝脏中几乎检测不到IGF-1基因的表达[6]。总之，血液中GH/GHR和IGF-1水平是动物生长发育的主要基础。

始丰微型牛是中国目前已知小型黄牛品系中体重最轻的类群，成年微型牛体重150 kg左右、体高90 cm左右，24月龄屠宰率50%，净肉率40%左右，肉用生产性能欠佳。国内关于其种质资源特性鲜有研究，是中国黄牛研究领域的空白。为探讨始丰微型牛体型分化的分子机制，本试验对普通体型天台黄牛和始丰微型牛的外周血生长激素轴相关指标进行了测定，以提供始丰微型牛的基础生理生化信息，并尝试对始丰微型牛体型形成机制进行初步阐释。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本研究的动物试验经扬州大学动物试验伦理委员会批准后开展工作。本研究采用的微型牛和较大体型天台黄牛来自浙江省天台县天台黄牛保种场，因微型牛公牛存留数目太少，仅选取13～16月龄的健康始丰微型牛9头(♀6，♂3)和较大体型天台黄牛9头(♀6，♂3)。

1.2 样品采集与处理

在早上空腹(禁食一晚，自由饮水)情况下，每头牛无菌颈静脉采血5 mL，加EDTA 抗凝，4 000 r/min离心，取上清，4 ℃保存，及时转移至实验室检测分析。

1.3 ELISA测定

针对生长发育相关因子GH、GHR和IGF-1，采用商用ELISA试剂盒(上海研瑾生物公司)进行测定。 具体方法如下：首先稀释ELISA试剂盒内各标准品，在酶标包被板上设定空白孔、标准孔和待测样品孔，在标准品孔中准确加样50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL，倍比稀释后轻微振荡，封板膜封板后置37 ℃温育30 min。然后洗涤5次，拍干。接着加入HRP酶标试剂50 μL，空白孔除外，重复温育、洗涤步骤，最后加入底物溶液(TMB)50 μL，轻轻震荡混匀，覆膜，37 ℃ 避光显色15 min后，每孔加终止液50 μL，终止反应，酶标仪(Labsystems MultiskanMS-352，芬兰)进行450 nm波长测量测定OD值。

1.4 数据处理

依据酶标仪测定数据，用SPSS 17.0 统计软件对试验数据进行统计分析，用独立样本t检验方法，分析不同体型组间3个指标的差异。

2 结 果

2.1 不分性别不同体型间3个因子含量的比较

不分性别下，微型牛组GH含量(27.68±2.46 μg/L)极显著低于对照组(31.67±3.52 μg/L) (P<0.01)；微型组GHR含量 (13.89±2.29 μg/L) 略高于对照组(12.90±1.66 μg/L)(P>0.05)；微型组IGF-1含量(20.36±2.84 μg/L) 略低于对照组(20.66±3.68 μg/L) (P>0.05) (图1)。说明生长激素水平高低仍然是影响天台黄牛体型大小的主要因素。

图1 不分性别情况下不同体型间3个因子含量比较**表示二者差异极显著(P<0.01)。下同Fig.1 Comparison of blood biochemical indices betweenminiature and normal body size cattle** represents highly significant difference(P<0.01)

2.2 母牛不同体型间3个因子含量的比较

母牛中，微型牛组GH含量(27.30±2.11 μg/L)极显著低于正常体型对照组(32.11±3.80 μg/L) (P<0.01)；微型组GHR含量(14.92±1.62 μg/L)反而极显著高于对照组(12.50±1.57μg/L) (P<0.01)；微型组IGF-1含量(19.49±2.99 μg/L)略低于对照组(20.74±4.14 μg/L)(P>0.05)。说明了母牛上，生长激素水平高低是影响体型大小的主要因素，然而微型组GHR含量反常过高，且IGF-1水平并未同步提升，暗示微型牛可能存在GH-GHR结合上的缺陷，从而导致微型牛生长发育受阻。

图2 母牛不同体型间3个因子含量的比较Fig.2 Comparison of blood biochemical indicesbetween miniature and normal body size of heifers

2.3 公牛不同体型间3个因子含量的比较

公牛中，微型牛组GH含量 (28.44±3.11 μg/L) 略低于对照组(30.77±3.01 μg/L)，GHR含量(11.78±2.05 μg/L)略低于对照组(13.71±1.65 μg/L)，IGF-1含量(22.10±1.54 μg/L)略高于对照组(20.52±2.88 μg/L)，3个因子含量两组间差异均不显著(P>0.05) (图3)。结果显示，公牛上，微型牛IGF-1含量并不低于大体型公牛。

图3 公牛不同体型间3个因子含量的比较Fig.3 Comparison of blood biochemical indicesbetween miniature and normal body size of bulls

3 讨 论

动物身高是由多种遗传因素决定的。动物矮小性状具有较强遗传性，身高的遗传力因品种而异，比如荷斯坦-弗利赞杂交牛身高的遗传力估计为0.71，安格斯牛0.83。动物矮小可分为成比例性和不成比例性两类情况。矮小动物群体往往是成比例的。矮小动物存在多种不同的遗传形式，各自具有独特的微进化过程。一种是人为有意选择(如中国版纳小型猪等品种)；另一种是利用杂交优势选择去除了纯合子引致的有害性状，如北欧红牛存在与高产奶量关联的某个基因缺失，纯合化会导致胚胎死亡；或者是因为存在着搭便车基因；还可能由于群体规模较小，存在遗传漂变[7]。

导致矮小性状最简单直接的机制是单基因突变。近几年，通过对矮小动物的SNP研究，发现了多个单基因突变引致的矮小性状。矮型婆罗门牛GH1上的T200M变异[8]，矮型比利时蓝牛RNF11剪切位点c.124-2A > G的变异[9]，矮型美洲安格斯牛PRKG2 上的无义突变C > T[10]，矮型日本褐牛EVC2上两个突变[11]，矮型Tyrolean 灰牛EVC2上2 bp (AC) 的缺失[12]，Dexter牛ACAN上的突变[13]，矮型Fleckvieh 牛GON4L上1 bp (C) 的缺失[14]；在其它动物上，还有矮小鸡的IHH[15]，GHR[16]上的缺失、Texel绵羊SLC13A1[17]的缺失，以及人GH1上的T175A变异[18]，等。天台黄牛属于中等偏小体型类，其中的始丰微型牛类群并不具有矮型婆罗门牛GH1的矮化位点(T200M)[19]，国内在黄牛体格大小形成机制方面的研究尚不充分，即使是已经熟知的矮小型猪、鸡[15]、马等，都未能充分阐明其矮小机制。本研究发现，在母牛上，GH水平高低是影响体型大小的主要因素，然而微型牛GHR含量反常过高，且IGF-1水平并未同步提升，仍低于对照，这一现象和杨宁等[6]在鸡伴性矮小的这3个基因表达研究结果基本一致，可能是GHR编码产物异常阻碍了GH-GHR-IGF信号通路, 不能发挥正常的生理功能。不过最终确定，是IHH基因的11 896 bp缺失，导致软骨发育期IHH表达水平降低，使得骨骼发育受阻[15]。另一方面，在公牛上，微型牛IGF-1含量并不低于大体型公牛，说明雄激素很可能促进了有别于GH/GHR-IGF1通路的其他促生长通路，而影响着公牛体型大小的形成。本研究由于微型牛公牛数目太少，无法扩大样本量，在以后的调查研究中，继续收集微型牛公牛样本。另一方面，增加考察雄激素水平的检测，了解微型牛群体中雄激素的水平。在机制方面，进一步验证牛上的其他矮化位点。

4 结 论

始丰微型牛母牛GH含量极显著低于正常体型天台黄牛，GHR含量却极显著高于对照组，且IGF-1水平并未同步提升，说明GH水平是影响体型大小的主要因素，始丰微型牛可能存在GH-GHR结合上的缺陷，导致其生长发育受阻。公母牛IGF-1含量有差异，可能受性激素通路的干扰。