Chi-miR-3031对奶山羊乳腺上皮细胞增殖和凋亡的研究

侯金星，李 胜，韩金澄，吴双虎，安小鹏，王沛捷，李云甫*

(1.杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西省畜牧技术推广总站,陕西 西安 710014；3.西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；4.三原县动物疫病预防控制中心，陕西 三原 713800)

乳腺上皮细胞是乳腺组织泌乳的基本单位，乳腺组织经历哺乳-退化-哺乳的循环途径影响乳腺上皮细胞增殖、分化、凋亡和重塑[1]。而这些循环过程中，乳腺上皮细胞受激素，生长因子，miRNAs等众多因素调控影响其功能[2]。有研究表明乳腺上皮细胞的增殖能力与乳腺的发育及泌乳等功能有密切的联系[1]。因此，本试验旨在探究miRNA对奶山羊乳腺上皮细胞增殖及凋亡的调控作用，这一结果对于探索乳腺发育等生物学功能具有重要的意义。

MiRNAs是一种长度为19～22 bp的内源性非编码RNA，miRNAs可以特异性结合到靶基因的3'端非翻译区(3'-UTR)，导致靶基因mRNA降解或被阻断翻译，从而在转录后水平调控基因表达[3-4]。细胞增殖[5]、凋亡[6]、分化[7]、免疫[8]、肿瘤[9]等重要过程都有miRNAs的参与。近年来发现miRNAs在乳腺发育过程扮演重要角色[10]。一方面，miRNAs可以通过调控PCNA，C-MYC，cyclinD1等增殖相关基因的表达调控细胞增殖[11]。另一方面，miRNAs可以通过调控Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡相关基因的表达调控细胞凋亡[12]。miR-214通过抑制PCNA以及WNT靶基因cyclinD1和C-MYC的表达负调控乳腺癌细胞的增殖[13]。此外，miR-573通过靶向Bax负调节Caspase3的表达影响核髓细胞的增殖和凋亡[14]。目前，Chi-miR-3031在奶山羊上皮细胞凋亡中的研究还很少，尽管Chi-miR-3031可以通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路下调IGFBP5的表达促进了奶山羊乳腺上皮细胞中β-酪蛋白的合成与分泌[15]。然而，Chi-miR-3031对乳腺上皮细胞其他功能的调控机制尚不清楚。

试验前期通过对低泌乳期(产后2 d)和泌乳高峰期(产后90 d)的乳腺组织进行高通量测序，根据生物信息学分析结果筛选出泌乳高峰期差异高表达的Chi-miR-3031[16]。因此，本试验首先在体外合成Chi-miR-3031的模拟物及其抑制剂，并将其转染至奶山羊乳腺上皮细胞中，通过CCK-8，RT-qPCR，Western blot的方法，探究Chi-miR-3031调控奶山羊乳腺上皮细胞增殖及凋亡的具体机制，为阐明miRNAs调控乳腺上皮细胞功能和乳腺发育的分子机制提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

本试验所用的乳腺组织采自扶风某奶山羊养殖场，将乳腺组织用PBS冲洗3次，然后放入灭菌的加有双抗的PBS溶液中，分离培养出乳腺上皮细胞。乳腺上皮细胞培养液:DMEM培养基(Gibco公司) 、10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)(Gibico公司)、1%青霉素链霉素混合液(Penicillin-Streptomycin Solution，PS)(Gibico公司)。细胞活力检测试剂盒(CCK-8)购自南京恩晶生物有限公司。封闭液: 含 5% 脱脂奶粉的 PBS。一抗: 小鼠抗β-ACTIN (稀释比1：1000)和兔抗Bcl2、Bax、Caspase3多克隆抗体(稀释比1：1000)。二抗：HRP标记的山羊抗小鼠(稀释比1:1000)和山羊抗兔抗体(稀释比1:500)。以上抗体均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞转染

根据Chi-miR-3031引物序列5'-GGGCTGGCTCCCTCGGCCCC-3'合成Chi-miR-3031的体外模拟物(mimic)，抑制剂(inhibitor)及其阴性对照组NC(negative control)，inhibitor NC。将奶山羊乳腺上皮细胞分别培养至6孔板和96孔板中，待细胞密度达到70%～80%进行转染。用细胞转染专用培养液OPTI-MEMI分别孵育Lipofectamine 2000及miRNA的模拟物5 min后，混合后加入细胞培养板中放置于37 ℃，5 % CO2恒温培养箱中20 min。6 h后将OPTI-MEMI培养液更换为F12培养液，继续培养24 h或48 h。

1.3 Western blot

根据1.2方法处理6孔板中的细胞，培养48 h后，按照说明提取蛋白质在115V电压下电泳2 h，后将蛋白转移至PVDF膜上，然后根据目的蛋白分子量选择合适的区间将PVDF膜切开，进行一抗、二抗的孵育、显影、照胶。

1.4 细胞活力检测(CCK-8)

根据1.2方法处理96孔板中的细胞，分别在培养21 h和45 h时每孔加入10 μL CCK-8溶液，避光继续培养3 h后用酶标仪测定490 nm的OD值。

1.5 数据统计与分析

试验处理得到的统计数据利用SPSS 22.0软件进行分析，显著性检验通过one-way ANOVA比较法进行运算。4次重复的数据结果均用平均数±标准差表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与方法

2.1 Chi-miR-3031对乳腺上皮细胞增殖的影响

通过CCK8法分别检测处理后24 h和48 h的山羊乳腺上皮细胞的活力。结果如图1A所示，与NC相比，Chi-miR-3031 mimic显著促进乳腺上皮细胞的活力(24 h和48 h，P<0.05)，而与inhibitor NC相比， miR-3031 inhibitor显著抑制乳腺上皮细胞活力(48 h，P<0.05)。RT-qPCR结果显示，与NC组相比，Chi-miR-3031 mimic显著提高PCNA，C-MYCmRNA的表达量。反之，与inhibitor NC组相比，3031 inhibitor显著降低PCNA和C-MYCmRNA的表达量(图1B～C)。

图1 Chi-miR-3031对乳腺上皮细胞增殖的影响A. CCK-8法检测细胞活力；B. 转染24 h后PCNA的mRNA表达水平；C. 转染24 h后C-MYC的mRNA表达水平;*表示P<0.05，**表示P<0.01。下同Fig. 1 Effect of Chi-miR-3031 on mammary epithelial cells proliferationA. Cell viability detected by CCK-8 assay; B. The mRNA expression of PCNA after transfection for 24 h;C. The mRNA expression of C-MYC after transfection for 24 h;* means P<0.05, ** means P<0.01. The same bellow

2.2 Chi-miR-3031对Bcl-2及bax蛋白表达量的影响

通过Western blot法检测细胞内抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达水平，结果如图2A所示，与NC组相比，Chi-miR-3031 mimic显著增加Bcl-2的蛋白表达量(P<0.01)，与inhibitor NC相比，miR-3031 inhibitor显著抑制Bcl-2的蛋白表达量(P<0.05)。随后，本试验进一步检测了细胞内促凋亡基因Bax的蛋白表达水平，如图2B所示，分别与NC、inhibitor NC相比较，Chi-miR-3031 mimic对Bax蛋白表达无显著影响，而miR-3031 inhibitor显著增加Bax蛋白表达量(P<0.05)。Bcl-2/Bax的比值可以作为判断细胞凋亡作用的标准。本试验中，与NC相较，Chi-miR-3031 mimic显著升高Bcl-2/Bax比值(P<0.01)，而与inhibitor NC相较， miR-3031 inhibitor显著降低Bcl-2/Bax的比值(P<0.01)，如图2C所示。

图2 Chi-miR-3031对Bcl-2/Bax蛋白表达的影响A. Western Blot 检测Bcl-2蛋白的表达；B. Western Blot 检测Bax蛋白的表达；C. Bcl-2/Bax蛋白表达比率Fig. 2 The influence of Chi-miR-3031 on theprotein expression of Bcl-2/BaxA. The protein levels of Bcl-2 were detected by Western Blot;B. The protein levels of Bax were detected by Western Blot;C. The rate of Bcl-2/Bax protein expression

2.3 Chi-miR-3031对Caspase3蛋白表达量的影响

如图3所示，与NC相比，Chi-miR-3031 mimic显著抑制Caspase3的蛋白表达(P<0.01)，与inhibitor NC相比，miR-3031 inhibitor显著促进Caspase3的蛋白表达(P<0.01)。

图3 Chi-miR-3031对Caspase3蛋白表达的影响(Western Blot检测)Fig. 3 The influence of Chi-miR-3031 on the proteinexpression of Caspase3 (detected by Western Blot)

3 讨 论

近年来，miRNAs在调控乳腺上皮细胞的增殖和凋亡[1]以及乳腺发育[17]过程中发挥关键作用。本试验通过高通量测序和生物信息学分析发现与初乳期相比，泌乳高峰期萨能奶山羊乳腺组织中差异高表达的Chi-miR-3031在乳腺发育和泌乳功能方面作用突出[15]。然而miRNA调控乳腺上皮细胞的功能是通过直接或者间接影响细胞内关键的功能因子实现的。一方面，研究表明不管是miR-498抑制食管癌的增殖与迁移[18]，还是低密度脂蛋白刺激下，miR-148b抑制血管平滑肌细胞增殖，诱导凋亡[19]，都能通过间接调控细胞中PCNA、C-MYC的表达来实现。本试验通过转染Chi-miR-3031至奶山羊乳腺上皮细胞中，结果发现与NC组相比，乳腺上皮细胞的数量与活力明显增加，并且细胞内PCNA、C-MYC的mRNA表达水平显著升高，这表明Chi-miR-3031能显著促进奶山羊乳腺上皮细胞的增殖，而Chi-miR-3031抑制剂能显著抑制乳腺上皮细胞的增殖，这与前人的研究完全一致[11,18,20]。此外，miR-203促进乳腺癌细胞的凋亡[21]，miR-216b抑制热应激诱导的牛乳腺上皮细胞凋亡[22]，还是miR-497抑制脐静脉内皮细胞增殖，诱导细胞凋亡[23]，都是通过间接激活Bcl-2、Bax、Caspase-3级联信号途径，形成凋亡复合体，诱导细胞核分裂，最终导致细胞凋亡。在本研究中，我们发现Chi-miR-3031能显著促进Bcl-2/Bax蛋白表达的比率，并且抑制Caspase-3蛋白的表达。这一结果表明，Chi-miR-3031通过促进Bcl-2/Bax的表达率以及负调控Caspase-3的表达能显著抑制奶山羊乳腺上皮细胞的凋亡，而Chi-miR-3031抑制剂能显著促进乳腺上皮细胞的凋亡。

另一方面，miRNAs能调控乳腺上皮细胞内乳蛋白的合成与分泌。研究表明，miR-148a，miR-186和miR-200a等miRNAs在乳中表达丰富，并且与牛乳腺泌乳量呈正相关。miR-18a、miR-221/222簇可调节乳中乳糖的合成[24]。Chi-miR-3031能通过下调IGFBP5的表达促进β酪蛋白的合成[15]。除此之外，miRNAs通过直接靶向结合mRNA序列的3'-UTR，形成沉默复合体，降解或阻断细胞内功能因子的转录与翻译，从而影响细胞的增殖与凋亡功能[3]。miR-24-3p靶向MEN1加速细胞内G1/S期转变，促进牛乳腺上皮细胞的增殖[25]。miR-21-3p靶向IGFBP5促进牛乳腺上皮细胞的活力和增殖[26]。

目前，关于Chi-miR-3031在乳腺方面的功能研究较少，尽管在本研究中证明了Chi-miR-3031能促进奶山羊乳腺上皮细胞的增殖，抑制细胞凋亡，但是这种调控机制不是直接的，而是间接调控的。因此，进一步筛选出Chi-miR-3031下游靶基因，这对于探究Chi-miR-3031在乳腺上皮细胞中增殖和凋亡的分子调控机制是十分重要的，这也为Chi-miR-3031调控乳腺发育的分子机制提供一定的理论基础。

4 小 结

综上所述，Chi-miR-3031通过调控PCNA、C-MYC的mRNA表达水平显著促进乳腺上皮细胞增殖。此外，Chi-miR-3031通过抑制Bcl-2/Bax/Caspase3级联信号抑制奶山羊乳腺上皮细胞的凋亡。