孙冬璇 杨挺 (北华大学附属医院,吉林 吉林 132000)
随着现代影像学和介入技术的不断发展,造影剂在临床的诊断和治疗中得到了越来越广泛的应用。随之而来的是由碘造影剂(IC)导致的一系列医源性并发症,造影剂肾病(CIN)就是其中之一〔1〕。目前临床多依靠肌酐诊断CIN。但有研究证实,肌酐受年龄、性别、肌肉质量、饮食、用药、水化状况等多种因素影响较大,且对于早期肾损伤缺乏敏感性及特异性,可能导致CIN 早期诊断困难,无法进行早期干预,影响治疗效果〔2〕。因此,探寻能够早期诊断CIN 的标志物对于临床诊断及治疗CIN 具有积极而重要的意义〔3,4〕。而有研究表明,中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)可以反映肾小管损伤,对CIN 的早期诊断较血肌酐更有优势〔5〕。故本研究旨在动态观察大鼠CIN 模型中NGAL 在血清及肾脏组织中的表达,评价NGAL 在大鼠CIN 模型中对早期CIN 的诊断价值。
1.1 实验动物 清洁级成年雄性SD 大鼠60 只,体重(200±16)g,由天津焱利华生物制品有限公司提供〔合格证号:SCXK(津)2018-00028〕。
1.2 主要试剂 吲哚美辛购于美国Sigma 公司;N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)购于美国Sigma 公司;碘帕醇370 购于上海博科莱信宜药业;NGAL 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、NGAL 抗体、二抗试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 方法
1.3.1 大鼠预处理 将60 只大鼠随机分为实验组和对照组,每组各30 只,禁食水12 h 后,经尾静脉注射吲哚美辛10 mg/kg,15 min 后经尾静脉注射L-NAME 10 mg/kg。
1.3.2 制备大鼠 CIN 模型参考研究〔6~8〕的方法,在接受预处理后15 min,实验组大鼠尾静脉注射碘帕醇370(3 gI/kg),建立CIN 大鼠模型;对照组处理方法同上,用生理盐水替代碘帕醇370。
1.3.3 血肌酐及血NGAL 检测 接受造影剂前及接受注射后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h 分别取两组大鼠内眦静脉血,测定大鼠血肌酐及血NGAL 水平。
1.3.4 肾脏病理变化 分别于接受造影剂前和接受注射后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,用麻醉剂过量(10%水合氯醛,0.5 ml/100 g)将两组大鼠各处死4只,打开腹腔经腹主动脉冰盐水反复冲洗,取双侧肾脏,去包膜经10%甲醛固定后石蜡包埋切片,用苏木素-伊红(HE)染色,在光学显微镜下对比观察大鼠肾脏病理变化。
1.3.5 NGAL 免疫组化 常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水后,枸橼酸抗原修复液抗原修复,3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性。在室温下用10%羊血清封闭30 min 后,加入NGAL 抗体并于4℃冰箱过夜。次日,将孵育后的切片用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。滴加生物素标记的二抗,37℃孵育30 min,PBS 缓冲液清洗后,进行二氨基联苯胺(DAB)显色及苏木素复染。对照组在相同条件下,用PBS 代替NGAL 抗体作阴性对照。
1.4 统计学方法 采用SPSS16.0 软件进行χ2检验。
2.1 两组血肌酐、血NGAL 水平比较 实验组大鼠血肌酐在接受造影剂后2 h、6 h 无明显变化,在12 h、24 h 有轻度增高,在48 h 明显升高,注射12 h后,实验组血肌酐水平明显高于对照组(P<0.05)。血NGAL 从接受造影剂后2 h 即开始明显升高,24 h达峰值,24 h 后呈下降趋势(P<0.05)。而对照组血NAGL 在各个时间点无明显变化(P>0.05)。注射2 h后,实验组NGAL 水平明显高于对照组(P<0.05)。见表1、表2。
表1 各组各时间点血肌酐水平比较(,n=3,mg/dl)
表1 各组各时间点血肌酐水平比较(,n=3,mg/dl)
与同一时间点对照组比较:1)P<0.05;与同组注射后12 h 比较:2)P<0.05;与同组注射后24 h 比较:3)P<0.05
表2 各组各时间点血NGAL 水平比较(,n=3,pg/ml)
与同一时间点对照组比较:1)P<0.05;与同组接受造影剂前比较:2)P<0.05;与同组注射后前一时点比较:3)P<0.05
2.2 肾组织病理学改变 实验组在注射后2 h 即出现肾小管细胞肿大;注射后6 h,肾小管细胞出现空泡变性,部分小管结构破坏;注射后12 h,肾小管细胞大量脱落,小管结构破坏明显;注射后24 h,肾小管细胞排列混乱,部分肾小管结构恢复;注射后48 h,肾小管细胞部分脱落,小管结构较前有所恢复。对照组各时间点肾脏未见明显病理改变。见图1。
图1 实验组各时间点肾脏病理改变(HE,×400)
2.3 NGAL 免疫组化 近端管状细胞细胞质中可见棕黄色着色即可说明NGAL 表达。实验发现,实验组注射后2 h 即可见棕黄色着色,随后逐渐增多,24 h 达高峰,随后呈下降趋势。对照组未见明显变化。见图2。
图2 实验组各时间点NGAL 表达(免疫组化,×400)
随着放射诊断及介入治疗技术的发展,IC 的使用也日益增多,而由注射IC 导致的CIN 已成为院内获得性肾衰竭的第3 大原因,占总发病率的11%。而伴有慢性肾脏病、糖尿病、高血压和心血管疾病等患者CIN 的发病率可达20%~50%〔9〕。CIN 患者多在接受造影剂后48~72 h 后,出现血肌酐升高,若血肌酐相对值升高25%或绝对值>44.2 μmol/L(0.5 mg/dl),并除外其他可能的原因则可明确CIN的诊断〔6〕。多数CIN 患者肾功能在造影后7~10 d逐渐恢复正常,但也有20%~30%的患者出现不可逆的肾脏损害,导致慢性肾衰竭的发生。
目前CIN 的发病机制尚不明确,但有研究指出IC 引起的肾脏血流动力学改变及其对肾小管的毒性作用等都是CIN 发生的重要原因〔10~12〕。IC 导致的肾脏血流动力学改变以肾髓质缺血缺氧为中心环节〔13,14〕。IC 可直接损伤肾血管内皮细胞,引起肾血流量减少。还可影响血管内皮细胞的分泌功能,导致收缩血管物质(如:内皮素、腺苷等)分泌增加,舒张血管物质(如:前列腺素、一氧化氮等)分泌减少,引起肾血管过度收缩,间接导致肾髓质的缺血缺氧〔15〕。另外,IC 对肾小管上皮细胞还具有直接毒性,可导致肾小管上皮细胞坏死、脱落〔16〕。
NGAL 是一条含有178 个氨基酸的多肽链〔17〕,属脂质运载蛋白,主要表达于肾小管髓袢及远端小管〔18〕。肾脏功能正常时NGAL 经肾小球滤过后,被近端小管重吸收。当出现肾脏缺血缺氧或肾毒性损害时,肾小管迅速分泌大量NGAL,引起血液中NGAL 含量大幅升高〔19〕。且近端小管受损,其重吸收功能障碍,故尿液中NGAL 含量亦大幅升高。另外,NGAL 还具有分子量小、不易在体内降解的特点〔20〕,故NGAL 易于采集,从血清或尿液中均可检出。本研究结果说明NGAL 在注射后2 h 即开始升高,其指标变化基本与肾脏病理改变同步,能比肌酐更早地反映出造影剂大鼠的肾脏损伤,对CIN 早期诊断具有临床意义。