白花蛇舌草多糖下调miR-21-5p/PAG1 对皮肤鳞癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

刘文选 （淄博市第一医院皮肤科,山东 淄博 255200）

随着人们生存环境变化、臭氧层破坏、室外活动增加等，皮肤鳞癌发病率有逐年增加趋势，严重威胁人们生命健康和生活质量〔1，2〕。皮肤鳞癌一般恶性程度较低，预后较好，但若病情未得到控制而发生转移则预后较差〔3，4〕。因此寻找控制皮肤鳞癌细胞有效治疗方法有重要意义。白花蛇舌草是茜草科耳草属植物白花蛇舌草的干燥全草，是一种传统的中草药，有抗癌、抗氧化、抗炎和保护神经等作用〔5〕。白花蛇舌草多糖（HDP）是白花蛇舌草的主要成分和重要的生物活性物质，有抗肿瘤和免疫调节作用，已被报道在体内外均能抑制肺癌、肝癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤的增殖和转移〔6～8〕。但目前HDP 对皮肤鳞癌细胞生物学行为的影响及其机制尚不清楚。本研究旨在探讨HDP 对皮肤鳞癌细胞A431 增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂 皮肤鳞癌A431 细胞（杭州仟诺生物科技有限公司）；HDP 溶液配制〔HDP 粉末（纯度90%）购自湖北省中药材公司，经HDP 粉末融于超纯水中，经0.48 μm 微孔过滤，灭菌15 min，制成浓度为800 μg/ml 的母液，冷却后封口，置于4℃冰箱中保存〕；胎牛血清、DMEM 培养基（Gibco 公司）；miR-21-5p 抑制物（miR-21-5p inhibitor，anti-miR-21-5p）及其阴性对照（miRNA inhibitor，anti-miR-NC）、miR-21-5p 模拟物（miR-21-5p mimics，miR-21-5p）及其阴性对照（miRNA mimics，miR-NC）、小干扰RNA无意义序列（siRNA-NC，si-NC）及siRNA-PAG1（si-PAG1）由广州锐博生物科技有限公司合成提供；四甲基偶氮唑蓝（MTT）溶液（5 mg/ml，Solarbio 公司）；Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒（Best Bio 贝博生物）；Trizol 试剂（Invitrogen 公司）；RIPA 裂解液（碧云天生物科技研究所）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染 皮肤鳞癌A431 细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，置于37℃、5%CO2的恒温饱湿培养箱中培养，待细胞生长至对数期，弃培养基并加入0.25%胰酶消化细胞，进行传代培养。取对数生长期A431 细胞，用含血清的DMEM 培养基重悬并调整细胞密度为1×105个/ml，以每孔200 μl 接种于6 孔板，置于培养箱中培养至细胞融合60%左右，使用Lipofectamine 2000 转染试剂，分别将anti-miR-NC、anti-miR-21-5p、miR-NC、miR-21-5p、si-NC、si-PAG1 分别转染至A431 细胞。

1.2.2 细胞分组 根据HDP 处理浓度不同，细胞分组:对照组 为Con 组，细胞不 做处理；HDP 100 μg/ml 组:细胞培 养液中 加入终 浓度为100 μg/ml的HDP 处理；HDP 200 μg/ml 组:细胞培养液中加入终浓度为200 μg/ml 的HDP 处理；HDP 400 μg/ml 组:细胞培 养液中 加入终 浓度为400 μg/ml的HDP 处理；HDP 800 μg/ml 组:细胞培养液中加入终浓度为800 μg/ml的HDP 处理。根据转染不同，细胞分组:anti-miR-NC 组:细胞转染antimiR-NC；anti-miR-21-5p 组:细胞转染anti-miR-21-5p；miR-NC 组:细胞转染miR-NC；miR-21-5p 组:细胞转染miR-21-5p；转染方法见1.2.1。HDP+miRNC 组:细胞转染miR-NC 后，给予HDP 200 μg/ml；HDP+miR-21-5p 组:细胞转染miR-21-5p 后，给予HDP 200 μg/ml；HDP+si-NC 组:细胞转染si-NC 后，给予HDP 200 μg/ml；HDP+si-PAG1 组:细胞转染si-PAG1 后，给予HDP 200 μg/ml。

1.2.3 MTT 比色法 调整A431 细胞悬液密度为2×104个/ml，以每孔150 μl 接种于96 孔板，置于培养基中培养24 h 后更换新鲜培养基，分别加入HDP终浓度〔9〕100、200、400、800 μg/ml处理，每个浓度设置5 个重复孔，分别于继续培养24 h、48 h、72 h 时，每孔加入20 μl MTT 溶液孵育4 h，吸除孔内液体，加入150 μl 二甲基亚砜溶液震荡孵育30 min。使用酶标仪检测每孔490 nm波长处吸光度值。

1.2.4 流式细胞仪实验 将A431 细胞以2×105个/ml接种于细胞培养瓶，培养48 h 后分别加入HDP 终浓度100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml、800 μg/ml处理，每个浓度设置5 个重复瓶，继续培养48 h 后收集细胞，调整细胞悬液密度为1×106个/ml，以每管1 ml 加入流式管中，1 000 r/min离心3 min，弃上清。参照Annexin V/PI 细胞凋亡试剂盒说明书，加入1 ml 1×结合缓冲液重悬细胞，然后分别加入5 μl Annexin V 和10 μl PI 染色液避光孵育，流式细胞仪中检测A431 细胞凋亡率。

1.2.5 Transwell 实验 收集经HDP 处理72 h 的A431 细胞，制成浓度为2×105个/ml 的单细胞悬液。取Transwell 小室，分别在小室的上室和下室加入150 μl 细胞悬液和600 μl DMEM 完全培养基，放于培养箱中培养24 h，取出小室，室温下吸去上室液体并加入甲醇固定，然后加入Giemsa 染色液染色，使用清水轻轻冲洗下室后用无菌棉签擦去上室表面细胞，200×显微镜下随机选取5 个视野区计数细胞迁移数目；另取Transwell 小室，分别在小室的上室和下室加入50 μl 基质胶和100 μl 基质胶和无血清DMEM 培养基1 ∶5混合液，并在上室中接种50 μl细胞悬液，培养24 h 后，吸除上室液体4℃下加入5%戊二醛固定，然后加入0.1%结晶紫染色，200×显微镜下随机选取5 个视野区计数细胞侵袭数目。

1.2.6 qRT-PCR 实验 收集上述生长状态良好的各组细胞，采用Trizol 法抽提总RNA，检测RNA 样品质量、浓度和完整性符合实验要求。进行反转录反应合成cDNA 后，以U6 为内参基因采用染料法进行qPCR 反应，检测细胞中miR-21-5p 相对表达量。数据处理方法采用2-△△Ct法。

1.2.7 Western 印迹 收集上述生长状态良好的各组细胞，加入RIPA 裂解液裂解提取总蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白样品浓度，向蛋白样品中加入5 倍体积的1×十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液混匀，放入沸水中充分变性。取30～50 μg 变性后的蛋白样品进行10%SDS-聚酰丙乙烯凝胶电泳（PAGE）。转膜，使用5%脱脂奶粉封膜1 h 后，加入稀释后的蛋白一抗4℃孵育过夜，然后加入稀释后的辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育2 h。显影、曝光，根据蛋白条带灰度值计算目的蛋白相对表达量。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验 为证实miR-21-5p 靶向PAG1，本研究将PAG1 的3＇UTR 和突变的3＇UTR 分别构建双荧光素酶报告基因载体，分别与miR-21-5p、miR-NC 共转染A431 细胞，转染48 h后收获细胞并检测细胞中荧光素酶活性。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0 软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结果

2.1 HDP 对皮肤鳞癌细胞A431 增殖、凋亡的影响 与Con 组比较，HDP 不同浓度组皮肤鳞癌细胞A431 中CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达显著降低，且呈浓度依赖性（P＜0.05），p21、Bax 蛋白表达显著升高，且呈浓度依赖性（P＜0.05），细胞增殖抑制率及凋亡率均显著增加，且呈浓度依赖性（P＜0.05）。选择HDP 作用时间72 h，抑制率约为50% 的浓度（200 μg/ml）进行后续实验。见图1、表1。

表1 HDP 对A431 细胞增殖、凋亡的影响(,n=15)

表1 HDP 对A431 细胞增殖、凋亡的影响(,n=15)

与Con 组比较:1）P＜0.05；与HDP 100 μg/ml 组比较:2）P＜0.05；与HDP 200 μg/ml 组比较:3）P＜0.05；与HDP 400 μg/ml 组比较:4）P＜0.05

图1 流式细胞仪检测HDP 对A431 细胞凋亡的影响

2.2 HDP 对A431 细胞迁移、侵袭及miR-21-5p 表达的影响 与Con 组比较，HDP 200 μg/ml 组A431细胞中miR-21-5p 相对表达量显著降低（P＜0.05），细胞中E-cadherin 蛋白表达显著升高（P＜0.05），MMP-2蛋白表达显著降低（P＜0.05），细胞迁移数目和侵袭数目显著减少（P＜0.05）。见图2、图3、表2。

图2 Transwell 实验检测HDP 对A431 细胞迁移、侵袭(结晶紫染色,×200)

图3 Western 印迹检测HDP 对A431 迁移和侵袭相关蛋白的表达

表2 HDP 对A431 细胞迁移、侵袭及miR-21-5p 表达的影响(,n=15)

表2 HDP 对A431 细胞迁移、侵袭及miR-21-5p 表达的影响(,n=15)

2.3 抑制miR-21-5p 表达对A431 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 与anti-miR-NC 组比较，antimiR-21-5p 组A431 细胞中miR-21-5p 相对表达量显著降低（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达显著降低（P＜0.05），p21、Bax 蛋白表达显著升高（P＜0.05），细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均显著升高（P＜0.05），细胞中E-cadherin 蛋白表达显著升高（P＜0.05），MMP-2 蛋白表达显著降低（P＜0.05），细胞迁移数目和侵袭数目显著减少（P＜0.05）。说明抑制miR-21-5p 能抑制A431 细胞增殖、迁移和侵袭并诱导A431 细胞凋亡。见表3，图4。

图4 Western 印迹检测A431 细胞中增殖、凋亡、迁移、侵袭蛋白表达

表3 抑制miR-21-5p 表达对A431 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响(,n=15)

表3 抑制miR-21-5p 表达对A431 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响(,n=15)

2.4 过表达miR-21-5p 能逆转HDP 对A431 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 与HDP+miR-NC 组比较，HDP+miR-21-5p 组A431 细胞中miR-21-5p 相对表达量显著升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达显著升高（P＜0.05），p21、Bax 蛋白表达显著降低（P＜0.05），细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05），细胞中E-cadherin 蛋白表达显著降低（P＜0.05），MMP-2 蛋白表达显著升高（P＜0.05），细胞迁移数目和侵袭数目显著增多（P＜0.05）。说明过表达miR-21-5p 后HDP 对A431 细胞的影响作用减弱。见图5，表4。

图5 Western 印迹检测A431 细胞中增殖、凋亡、迁移、侵袭蛋白表达

表4 过表达miR-21-5p 能逆转HDP 对A431 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的作用(,n=15)

表4 过表达miR-21-5p 能逆转HDP 对A431 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的作用(,n=15)

2.5 miR-21-5p 靶向调控PAG1 生物信息学软件分析发现miR-21-5p 能够与PAG1 的3＇UTR 互补结合，见图6；双荧光素酶报告基因实验证实，过表达miR-21-5p 明显抑制A431 细胞中PAG1 转录活性，而将PAG1 的3＇UTR 突变后抑制作用消失。见表5。Western 印迹表明，过表达miR-21-5p 的A431 细胞中PAG1 蛋白表达明显降低（P＜0.05），而抑制表达miR-21-5p 的A431 细胞中PAG1 蛋白表达明显升高（P＜0.05）。见图7、表6。

表6 miR-21-5p 调控PAG1 mRNA 和蛋白表达(,n=15)

表6 miR-21-5p 调控PAG1 mRNA 和蛋白表达(,n=15)

与miR-NC 组比较:1）P＜0.05；与anti-miR-NC 组比较:2）P＜0.05

图6 miR-21-5p 和PAG1 的互补序列

表5 双荧光素酶报告实验(,n=15)

表5 双荧光素酶报告实验(,n=15)

图7 miR-21-5p 调控PAG1 的表达

2.6 抑制PAG1 能逆转HDP 对A431 细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的作用 与HDP+si-NC 组比较，HDP+si-PAG1组A431 细胞中PAG1 蛋白表达显著降低（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达显著升高（P＜0.05），p21、Bax 蛋白表达显著降低（P＜0.05），细胞增殖抑制率和细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05），细胞中E-cadherin 蛋白表达显著降低（P＜0.05），MMP-2 蛋白表达显著升高（P＜0.05），细胞迁移数目和侵袭数目显著增多（P＜0.05）。见图8、表7。说明抑制PAG1 后HDP 对A431 细胞的影响作用减弱。

图8 Western 印迹检测A431 细胞中增殖、凋亡、迁移、侵袭蛋白表达

表7 抑制PAG1 能逆转HDP 对A431 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的作用(,n=15)

表7 抑制PAG1 能逆转HDP 对A431 细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的作用(,n=15)

3 讨论

中药辅助抗肿瘤治疗是提高或改善肿瘤放化疗治疗的有效手段。中药白花蛇舌草始载于《神农本草经》，其成药味苦、淡，性寒，临床实践表明白花蛇舌草若配伍得当可用于治疗各类炎症、肿瘤、泌尿系统感染等多种疾病〔10～12〕。研究发现白花蛇舌草主要含有黄酮类、萜类、甾醇类、多糖类、有机酸类、生物碱、蒽醌类等活性成分，其中抗肿瘤活性的成分包括总多糖、总黄酮、甾醇类、三萜类等〔13〕。HDP 的抗肿瘤作用已有报道，如Lin 等〔6〕报道HDP 通过EGFR/Akt/ERK 信号通路抑制细胞上皮间充质转换，从而阻断肺腺癌细胞的转移能力；景艳等〔14〕报道HDP 可通过调控细胞凋亡途径诱导鼻咽癌细胞凋亡；张韬等〔15〕报道HDP 能够有效抑制骨肉瘤细胞的增殖，阻滞细胞周期和促进细胞凋亡。

本研究结果表明HDP 能有效抑制A431 细胞增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡。提示HDP 在皮肤鳞癌治疗中可能起积极抗肿瘤作用。

miRNA 在肿瘤中的抗癌或促癌作用已得到广泛研究。Bruegger 等〔16〕分析了健康皮肤细胞和皮肤鳞癌细胞中miRNA 表达的差异，发现miR-21、miR-31、miR-205 在皮肤鳞癌细胞中显著上调，作为癌基因参与皮肤鳞癌的发生和发展。本研究结果提示HDP 对A431 细胞的作用可能与抑制miR-21-5p表达有关。

PAG1 是一种跨膜接头蛋白，研究认为PAG1 可通过调节Src 家族成员激酶活性参与肿瘤细胞生长、转化等病理过程〔17，18〕。李美佳等〔19〕报道，PAG1过表达通过抑制皮肤鳞癌细胞移动能力而抑制其迁移和侵袭。本研究结果说明抑制PAG1 后HDP 对A431 细胞生物学行为的影响减弱，提示HDP 是通过抑制A431 细胞中miR-21-5p 表达，进而靶向上调PAG1 表达而发挥作用。