抑制CTNNA3 表达对小鼠哮喘模型肺部气道炎症的影响

田迎 宁艳硕 王晶 张菊香 赵卫国 王品 彭钰红 高春蕾

（1 哈励逊国际和平医院,河北 衡水 053000;2 河北医科大学附属第一医院）

哮喘是一种由多种炎症细胞和细胞因子参与调控的严重危害人和动物健康的慢性气道炎症性疾病，表现为慢性气道炎症，气道功能下降和气道重塑〔1〕。我国第3 次城市老年哮喘流行病学调查资料显示，全国城市2010 年哮喘患病率为3.02%〔2〕，严重影响了患者的生命质量和家庭幸福感。重症哮喘患者即使使用高剂量糖皮质激素和长效β2激动剂仍无法有效控制病情〔3〕。尽管重症哮喘患者为数不多，但其所需的治疗费用却占哮喘总费用的一半〔4〕。目前针对重症哮喘患者并没有较为有效的治疗方法。研究显示，由CTNNA3 编码的αT-钙黏着蛋白关联蛋白（αT-cat）基因多态性与哮喘的恶化程度相关〔5，6〕。α-catenins 是钙黏蛋白和细胞骨架的肌动蛋白丝之间的连接蛋白，是整个机体组织中主要的细胞黏附系统〔7〕。α-catenins 有3 种形态，即αE-cat、αN-cat 和αT-cat〔8〕。其中，αT-cat 在功能上似可有可无，小鼠敲除αT-cat 后仍可正常存活及繁殖〔9〕。然而，随着年龄的增长及射血分数降低，这些基因敲除小鼠可发生心肌病，这与αT-cat 在心脏中富集表达是一致的〔10〕。文献报道，αT-cat 在肺部也有表达，但在肺组织中表达更广泛的是αE-cat，αT-cat 的表达极少，仅围绕肺静脉心肌细胞的细胞层〔11〕。在小鼠过敏性哮喘模型中，有研究者观察到肺静脉周围总有炎症发生〔12〕，但αT-cat 在调节气道炎症方面的作用目前尚不清楚。本研究采用卵清蛋白（OVA）诱导建立CTNNA3 敲低小鼠过敏性哮喘模型，研究CTNNA3 对过敏性小鼠哮喘模型中肺静脉炎症的影响，鉴于αT-cat 仅在肺静脉周围表达，假设αT-cat 通过调控肺静脉周围组织炎症来参与气道炎症过程，以此探讨CTNNA3 在调节哮喘发作中的具体作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 OVA 及αT-cat 单克隆抗体（#952）及硫酸铝钾（分析纯）（美国 Sigma 公司）；PARIL30Y 高频雾化器（德国百瑞公司）；多聚甲醛（天津市博爱化工）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒G1120（北京索莱宝）；酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒白细胞介素（IL）-1β、IL-4、IL-10、干扰素（IFN）-γ（武汉博士德）；Trizol、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒（日本Takara 公司）；RT-PCR 引物、AAV-CTNNA3 腺相关病毒过表达重组载体（NM_001164376.1）、AAV-shCTNNA3 腺相关病毒敲低重组载体构建及包被（上海生工生物），shCTNNA3 Oligo:上游引 物 5＇-CACCGCAGCAGTTACAAGACTCCTTGTTCT CGAAAGAACAAGGAGTCTTGTAACTGCTG-3＇，下游引 物5＇-AAAACAGCAGTTACAAGACTCCTTGTTCTTTCGAGAACAAGGAGTCTTGTAACTGCTGC-3＇。

1.2 实验分组及OVA 哮喘模型制备 实验分组:18～20 g C57BL/6 小鼠尾静脉注射50 μl 重组腺病毒，敲低病毒注射（AAV-shCTNNA3）滴度为1×108PFU/ml，过表达病毒注射（AAV-CTNNA3）滴度5×108PFU/ml。实验分组如下:control 组、AAV-shCTNNA3 组、control+OVA 组、AAV-shCTNNA3+OVA组、AAV-CTNNA3 及AAV-CTNNA3+OVA 组，每组9只，共54 只，在末次OVA 激发24 h 后对其进行气道反应检测，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）、肺部灌洗液4℃保存并尽快对炎症细胞数目及炎症细胞因子IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ 等指标进行测定，收集肺部气道、肺及肺右上静脉等组织进行液氮冻存，测定CTNNA3 表达、炎症细胞因子等，以评价CTNNA3 对哮喘小鼠气道炎症的促进作用。

OVA 小鼠哮喘模型制备:参考文献〔13，14〕。各组先进行1 w 的适应性饲养。在第0、7、14 天，AAVshCTNNA3 组、AAV-shCTNNA3+OVA 组及AAV-CTNNA3+OVA 组均腹腔注射 OVA 致敏液（250 μg/ml），0.1 ml/只，而control 组、control+OVA组及AAV-CTNNA3 组注射等量的磷酸盐缓冲液（PBS）。在第24～27 天，各组经乙醚麻醉后滴鼻OVA 激发液，50 ml/只，并对致敏后进行激发的各组小鼠行为学观察。

1.3 高频振荡法 末次OVA 激发24 h 后，各组通过Buxco 肺功能仪来测定气道反应性的强弱。具体方法为:利用2%戊巴比妥钠盐（55 mg/kg）麻醉小鼠进行气管插管并连接小动物呼吸机，频率2 000 r/min，潮气量0.14～0.16 ml，以此测定各组小鼠的气道压力，并计算气道阻力值（RI）。每次雾化之后均进行记录。用来激发的乙酰甲胆碱（mCh）的浓度梯度为:0、5、10、25、50、100、200 mg/ml。测定结果进行分析，并进行数据处理。

1.4 支气管肺泡灌洗（BAL）收集BALF:测定小鼠反应性后，使用气管插管到肺段，向支气管肺泡内快速注4℃预冷灭菌生理盐水1 ml 后，在80～100 mmHg负压下吸引回收液，反复灌洗2～3 次，收集1 ml BALF 进行细胞总数、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及淋巴细胞的分类计数。步骤如下:①BALF 细胞沉淀作涂片；②4%多聚甲醛固定，姬姆萨染液染色；③计数细胞，于显微镜下观察细胞，根据细胞形态用白细胞分类计数器进行分类计数，每张片计数200 个细胞，最终细胞数=各类细胞总数×百分比；每组重复3 次；④在剩余细胞沉淀中加入预冷PBS，吹打混匀，吸取1 ml 用智能细胞计数器计数细胞总数，余下细胞进行ELISA 测定细胞因子。

1.5 实时荧光定量PCR 截取各组肺组织及右肺上静脉段样本约20 mg，分别用Trizol 匀浆提取总RNA，根据逆转录试剂盒合成cDNA，PCR 体系参考Takara 产品使用说明书，PCR 引物序列CTNNA3:正义链:5＇-AGCGAAATTGACTGCCCCAC-3＇，反义链:5＇-CTGACATGCTGCCTTTCTGTT-3＇；GAPDH:正 义链:55＇-GGAGTCCACTGGTGTCTTCA-3＇，反义链:5＇-GGGAACTGAGCAATTGGTGG-3＇。每个样本3 个复孔，按两步法PCR 扩增，条件为Step 1:95℃30 s；Step 2:95℃5 s，60℃30 s（40 cycles）。反应结束后确认RT-PCR 的扩增曲线及溶解曲线是否满足要求，仪器软件中自动输出Ct 值，计算相对表达量采用2-△△Ct方法。

1.6 Western 印迹 收集各组肺组织及右肺上静脉段样本，提取各组织中的总蛋白并测定蛋白浓度，处理好的待测样品取50 μg 蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转膜，将分离的蛋白电转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。封闭液室温封闭1 h，经一抗孵育后，4℃过夜。TBST充分洗膜后，加入二抗（1 ∶2 000）室温孵育1 h，TBST 清洗后显色液显色照相。

1.7 HE 染色 各组小鼠在末次激发24 h 后取肺组织，于4%多聚甲醛中进行固定，经酒精脱水、二甲苯通透后进行石蜡包埋，蜡块切片厚度为0.8 μm。HE 染色后，在显微镜下对染色组织的炎症情况进行观察。

1.8 ELISA 取各组小鼠肺静脉组织样本，加入等体积蛋白裂解液将匀浆组织，离心取上清液，并按试剂盒说明书设置标准品、样品及阴性对照等。按照剂盒说明书步骤处理收集样本，用酶标仪在450 nm波长处测定各孔的OD 值，观察记录结果。

1.9 统计学方法 采用SPSS19.0 软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结果

2.1 各组行为学观察 control 组CTNNA3 mRNA水平（1.07 ±0.11）显著高于AAV-shCTNNA3 组（0.39±0.15，P＜0.05），control 组aT-cat 蛋白水平（0.97±0.32）显著高于AAV-shCTNNA3 组（0.47±0.07，P＜0.05）。见图1。

图1 Western 印迹检测αT-cat 的表达

与control 组和AAV-shCTNNA3 组相比，control+OVA 组和AAV-shCTNNA3+OVA 组小鼠经OVA 诱导后的行为学变化较大，激发过程中存在不同程度的抽搐、呼吸急促、烦躁不安等症状，激发第2 天则开始产生阳性反应，大便次数统计结果显示，control组〔（5 ± 2）次/d〕 和 AAV-shCTNNA3 组〔（6 ±1）次/d〕显著低于control+OVA 组〔（11±2）次/d，P＜0.05〕 和 AAV-shCTNNA3+OVA 组〔（13 ±3）次/d，P＜0.05〕；呼吸频率统计结果显示，control组〔（118±9）次/min〕和AAV-shCTNNA3 组〔（106±13）次/min〕 显著低 于control+OVA 组〔（153 ±11）次/min，P＜0.05〕和AAV-shCTNNA3+OVA 组〔（146±3）次/min，P＜0.05〕。

2.2 抑制αT-cat 表达可缓解OVA 诱导的过敏性哮喘 mCh 浓度为0、5、10、25、50、100、200 mg/ml 时control 组和AAV-CTNNA3 组气道阻力值差异均无统计学意义（均P＞0.05）；当mCh 浓度为0、5、10 mg/ml时，control+OVA 组和AAV-CTNNA3+OVA组气道阻力值差异均无统计学意义（均P＞0.05）；当mCh 浓度为25、50、100、200 mg/ml 时，control+OVA 组气道阻力值均显著高于AAV-CTNNA3+OVA组（均P＜0.05），见表1。control 组和AAV-CTNNA3组炎性细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数目差异均无统计学意义（均P＞0.05）；control+OVA 组炎性细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数目均显著高于AAV-CTNNA3+OVA 组（均P＜0.05）。见表2。表明下调CTNNA3 可能对过敏性哮喘模型小鼠有保护作用。

表1 各组气道阻力值比较(,n=9,cmH2O·s/ml)

表1 各组气道阻力值比较(,n=9,cmH2O·s/ml)

与control+OVA 组比较:1）P＜0.05；表2、3 同

表2 各组支气管肺泡灌洗液中炎性细胞数目比较(,n=9,×104 个/ml)

表2 各组支气管肺泡灌洗液中炎性细胞数目比较(,n=9,×104 个/ml)

2.3 抑制αT-catenin 表达显著降低OVA 模型小鼠肺静脉中的炎症反应 control 组和AAV-CTNNA3组IL-1β、IL-4、IL-10、IFN-γ 差异均无统计学意义（均P＞0.05）；control+OVA 组IL-1β、IL-4 水平均显著高于AAV-shCTNNA3+OVA 组，而IL-10、IFN-γ 水平均显著低于AAV-shCTNNA3+OVA 组（均P＜0.05）。见表3、图2。表明CTNNA3 可能在肺部静脉组织OVA 激发情况下起着促进作用。

图2 下调αT-cat 减缓OVA 诱导的过敏性哮喘(HE,×200)

表3 各组肺静脉组织中免疫细胞因子表达水平比较(,n=9,pg/ml)

表3 各组肺静脉组织中免疫细胞因子表达水平比较(,n=9,pg/ml)

2.4 增加CTNNA3 表达促进OVA 小鼠哮喘模型中肺静脉炎症 control 组CTNNA3 过表达后的mRNA相对表达量（1.05±0.08）显著低于AAV-CTNNA3组（5.37±0.81，P＜0.05）。见图3。未暴露于OVA中的CTNNA3 过表达小鼠AAV-CTNNA3 组炎症因子IL-1β、IL-4 显著高于control 组，IL-10、IFN-γ 显著低于control 组（均P＜0.05）；而暴露于OVA 中的CTNNA3 过表达小鼠AAV-CTNNA3+OVA 组炎症因子IL-1β、IL-4 显著高于control+OVA 组，IL-10、IFNγ 显著低于control+OVA 组（均P＜0.05）。见表4。

图3 上调αT-cat 促进OVA 模型中肺静脉炎症

表4 各处理组肺静脉组织中免疫因子表达(,n=9,pg/ml)

表4 各处理组肺静脉组织中免疫因子表达(,n=9,pg/ml)

与control 组比较:1）P＜0.05；与control+OVA 组比较:2）P＜0.05

2.5 肺静脉炎症促进过敏性哮喘气道炎症的发生 control+OVA 组气道炎症明显高于AAV-shCTNNA3+OVA 组，且与肺静脉的距离越远，两组气道炎性细胞数目均降低（P＜0.05），见表5、图4。

表5 各组炎性细胞数目比较(,n=9)

表5 各组炎性细胞数目比较(,n=9)

与control+OVA 组比较:1）P＜0.05；与本组前一距离比较:2）P＜0.05

图4 肺静脉炎症促进气道炎症的发生

3 讨论

哮喘是一种由嗜酸性粒细胞浸润为主并参与调控的慢性气道炎症〔15〕。哮喘治疗不仅要对症，更要控制潜在的气道炎症〔16〕。哮喘主要的防治方式是吸入糖皮质激素。但重症哮喘患者却对这种激素治疗方式有抵抗，无法有效控制病情〔3〕。研究数据显示，携带αT-cat SNP 突变的哮喘患者对糖皮质激素耐药〔5〕。研究表明小鼠过敏性哮喘模型易引发肺静脉炎症〔6〕。本研究结果提示肺静脉为中心的炎症可能对气道炎症有显著增强作用；小鼠哮喘模型中的肺静脉炎症促进了过敏性气道炎症的发生，提示αT-cat 在过敏性气道炎症的发生中有促进作用。

支气管哮喘是一种常见的气道慢性炎症性呼吸系统疾病〔17，18〕。研究显示，支气管哮喘的致病机制非常复杂，一般是在环境变应原和遗传因素双重作用下影响Th1/Th2 细胞分化，导致哮喘的发生〔19〕。研究显示支气管哮喘气道炎症的发病机制存在许多信号通路及靶点，如sFRP2 通过Wnt/β-catenin 途径促进COPD 气道炎症和Th17/Treg 失衡〔20〕。Brg1通过抑制PI3K/Akt/mTOR 通路加重哮喘气道炎症〔21〕。Rho 激酶抑制剂〔22〕、Sirtuins〔23〕等参与了支气管哮喘发病过程，成为靶向治疗支气管哮喘的新靶点。本研究表明由CTNNA3 基因编码的αT-cat在调节支气管哮喘方面发挥重要作用，有望成为哮喘治疗药物研发的潜在靶点。

目前治疗支气管哮喘主要是集中在症状缓解，尚无治愈支气管哮喘的方法〔24，25〕。研究表明多种中药制剂及活性化合物通过调控TGF-β、NF-κB 等炎症信号的表达参与哮喘气道炎症。马黄汤通过TLR9 通路改善支气管哮喘症状〔26〕。表没食子儿茶素没食子酸酯通过TGF-β1 通路改善哮喘小鼠气道炎症〔27〕。鱼藤素通过抑制NF-κB 通路减轻小鼠过敏性气道炎症〔28〕。方消方通过抑制TGF-β/Smad3信号通路减轻哮喘大鼠气道炎症和气道重塑〔29〕。上述研究表明支气管哮喘的治疗除了对中药复方及各种生物活性化合物的筛选外，其主要发病机制的研究及治疗靶点的发现也十分关键。