用人工哺乳新生仔猪进行临床分离PEDV-XS12 的LD50 测定

王 剑,徐慧明,门程芳,徐一凡,于瑞嵩,董世娟,谢春芳,李 震

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海市农业遗传育种重点实验室,上海 201106)

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的一种高发病率、高死亡率的接触性肠道传染疾病[1-4]。 在我国,由于常年保持较高的生猪存栏量,因此,猪群腹泻病常年频发。 其中,PEDV 的感染在我国猪群腹泻病中占主导地位[5-9],造成巨大的经济损失。 2010—2013 年,PED 在我国、亚洲其他国家和美国相继大规模暴发[10-19]。 当前,对该病进行控制的有效手段只有通过免疫妊娠母猪,使初生仔猪通过母乳而获得免疫,但母猪抗体水平与仔猪保护的相关性研究目前还比较缺乏,其中原因之一就是既没有统一的攻毒模型,也没有大家公认的PEDV毒株用于建立攻毒模型。 半数致死量(Median Lethal Dose,LD50)原指在规定时间内,通过指定途径,使一半受试动物死亡的有害物质、有毒物质或游离辐射的最小剂量[20-22]。 LD50的单位常用受试物质质量与受试动物质量之比表示[23-24],比如mg∕kg 或copies∕mL。 LD50是评价药物优劣的重要参数,是衡量药物及一切与人类或动物体接触物质的安全标尺,对重复给药试验的剂量设置和药物临床试验的起始剂量、最小有效剂量等指标的选择具有重要参考价值。 如今,LD50已经广泛应用于医学、兽医学、药学等生命科学研究领域,是新药非临床安全性评价的重要指标[25-26],对后续新药临床试验至关重要。

猪流行性腹泻是一种侵害初生仔猪重要猪病,呈世界流行[1-3]。 疫苗是该病的唯一防控办法,但目前PEDV 疫苗研制仍困难重重,缺少稳定可靠、可用于评估PED 疫苗的LD50攻毒模型是困难之一。 然而,国内外尚没有公开发表与PEDV 有关的LD50试验数据。 本研究对PEDV 肠毒株进行鉴定并扩增,利用qPCR对扩增后的PEDV 进行含量鉴定。 因目前未免疫PEDV 猪场很少,故采用人工饲喂,使用未吃初乳3 d 内的新生仔猪。 受试动物经口服途径攻毒,并对其采食量、体重、体温等生理指标进行24 h、为期7 d 的观察与记录。 通过改进寇氏法和Bliss 法计算PEDV-ZJXS12 LD50、LD0、LD100、i等。 本研究的方法及结果可为建立PEDV 新生仔猪的攻毒模型提供参考依据,对其他冠状病毒疫苗的攻毒模型同样具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 毒株及实验动物

PEDV 毒株:源自实验室保存的经哺乳期仔猪接种扩增的流行性肠毒,后经基因进化树、基因遗传进化和基因同源性分析[27]。 分析结果表明,该毒株为流行毒株,在本研究中命名为PEDV-XS12 毒株。

实验动物:PEDV-XS12 肠毒增殖的动物购自隆宇科技农业发展有限公司试验用猪犬饲养中心,合格证编号:201827470。 LD50试验动物购自哈尔滨周边地区,体重(1.48 ±0.15)kg,公母各半,其父本均为‘杜洛克’,母本为‘大白’或‘长白’。 上述实验动物均为未吃初乳的PEDVAg-∕Ab-新生1 日龄健康仔猪。

1.2 PEDV-XS12 富集与定量

1.2.1 PEDV-XS12 富集

无菌环境下,小肠组织匀浆液经0.9%氯化钠注射用水稀释至无肉眼可见组织的病毒液,4 ℃备用。

普通级环境下,对若干头 PEDVAg-∕Ab-新生 1 日龄健康仔猪进行人工预饲 1 d,随后以 1 ×106copies∕mL、5 mL∕kg 病毒浓度经口灌服仔猪(灌服前须停饲1 次)。 待仔猪进入 PED 临床明显期初期,即食欲下降并出现首次腹泻时,立刻麻醉、剖杀,取小肠。 无菌环境下,将上述样品匀浆并经0.45 μm、0.22 μm 一次性滤器过滤,-80 ℃保存,待测。

1.2.2 病料PEDV RT-PCR 鉴定

通过检索美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)基因库设计相关引物(表1)分别对 FMDV、TGEV、PCV2、CSFV、PPV、PRV、PDCoV、SSⅡ、PEDV 这 9 种病毒进行鉴定,排除试验动物被其他疾病感染、致死的可能性。

表1 猪传染性疾病引物Table 1 The list of primers of swine infectious diseases for RT-PCR

1.2.3 PEDV-XS12 qPCR 定量

引物与探针设计:利用MegAlign 软件对NCBI 数据库下载的多条PEDV-M 基因进行同源性分析,Primer Premier 软件设计引物与荧光探针(表2),并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 PEDV-M阳性标准品制备:首先,病毒匀浆液经核酸提取、cDNA 制备及扩增、1%凝胶电泳鉴定;其次,鉴定无误后,分别将上述产物进行胶回收、连接与转化(pMD®18-T Vector);最后,质粒提取、定量,并将其换算成拷贝数。 标准曲线制备:对上述反转录后的cDNA 样品进行10 倍稀释,上机检测。

表2 PEDV-M 基因引物针序列Table 2 The sequences of primers and probe for PEDV-M

1.3 PEDV-XS12 攻毒

LD50试验均在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物福利伦理委员会(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)的严格指导下进行操作,IACUC 编号:HVRI-IACUC-2018-016。 实验动物使用许可证编号:SYXK(黑)-2017-009。

1.3.1 最小致死剂量与最大耐受剂量

普通级环境下,通过UDP、FDP 分别估算出最小致死剂量(Minimum Lethal Dose,LD100)、最大耐受剂量(Maximum Tolerable Dose,LD0)。

1.3.2 PEDV-XS12 LD50

分组:PEDV-XS12 LD100、PEDV-XS12 LD0实验动物均为 10 头∕组,其余各组为 8 头∕组,共 6 组。 受试动物采用人工饲喂,每次饲喂间隔3 h,预饲24 h,试验周期7 d。 饲养环境均为生物安全等级(Biological Safety Level,BSL)-3 级,环境温度30 ℃、湿度50%—60%、光照12 h 的屏障系统。

攻毒与临床观察:依据估算结果,对LD100和LD0的浓度做出预判,并计算出相邻两组剂量间的组距(Interval,i)、各组间浓度(表3)。 最终,以5 mL∕kg 病毒液经口灌服仔猪(灌服前须停饲1 次)。 试验期间密切观察仔猪临床症状、记录仔猪体温、体重、采食量等各项体征指标(表4)。

表3 LD50分组计算明细Table 3 The list of PEDV concentration and interval for LD50

表4 LD50体征指标记录Table 4 The list of pathological parameters for LD50 observation

2 结果与分析

2.1 PEDV-XS12 病料 RT-PCR 鉴定

通过RT-PCR 技术,排除受试动物临床常见传染疾病。 由图1 可知,在扩增的前8 种传染病中,样品的结果均为阴性。 根据PEDV 检测结果显示,其M基因片段大小为468 bp,样品与阳性对照条带一致,水平位置略低于500 bp Marker,阴性对照无条带。 因此,判断该样品只含有PEDV 流行毒株,即PEDV-XS12的核酸。

图1 1%琼脂糖凝胶电泳筛选结果Fig.1 The result of 1% agarose gel electrophoresis

2.2 病料PEDV-XS12 qPCR 载量检测

由图2 可知,PEDV qPCR 斜率为-0.030,扩增效率为113.8%。 用微量分光光度计测定质粒OD260值,并通过质粒浓度换算公式计算拷贝数(图2、图3)。

图2 PEDV qPCR 标准曲线Fig.2 The standard curve of PEDV qPCR

图3 目的基因PEDV-M 扩增曲线Fig.3 The result of amplification curve for PEDV-M gene

2.3 PEDV-XS12 LD50对仔猪体征的影响

2.3.1 PEDV-XS12 LD100对仔猪的影响

以200 copies∕mL、5 mL∕kg 的剂量对受试动物口服攻毒,通过动态监测受试动物的采食量、体重、体温、24 h 排泄量(粪和尿)、死亡头数,初步判断PEDV-XS12 LD100浓度。 如图4a 所示,口服攻毒1 d 与对照组相比,所有受试动物采食人工乳量均大幅提高(P＜0.01),其中,有6 头仔猪达到147.6 mL∕d。 24 h排泄量虽然也相应升高(P＜0.01),达到80.9 mL∕d,但有5 头低于该组的均值(图4 d)。 攻毒2 d 与对照组相比,受试动物的采食量均值虽仍维持在高水平(P＜0.01),但平均体重却没有增长,且平均24 h 排泄量和平均体温分别出现增加和下降趋势(P＜0.01),其中平均体温为36.64 ℃,较对照组体温下降1.2 ℃(图4c—d)。 攻毒后3—7 d,受试动物进入感染的临床明显期,受试动物的各体征指标波动较大,死亡头数增加。 其中,随着攻毒后时间的延续,其平均采食量与平均24 h 排泄量呈负相关,与平均体重和平均体温趋势分别呈正相关。

图4 仔猪PEDV-XS12 LD100的体征指标Fig.4 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD100 of PEDV-XS12

截至第6 天,所有受试动物100%死亡,PEDV-XS12 LD50死亡时间为59—133.5 h,平均死亡时间为83 h。

2.3.2 PEDV-XS12 LD0对仔猪的影响

PEDV-XS12 LD100的合理浓度为 200 copies∕mL,本组别以上述浓度的 1∕10(20 copies∕mL)、5 mL∕kg 的剂量对受试动物口服攻毒。 通过动态监测受试动物的采食量、体重、体温、24 h 排泄量、死亡头数体征指标,初步判断PEDV-XS12 LD0浓度。 口服攻毒后1 d,平均体温为38.7 ℃,较对照组升高0.6 ℃,而平均24 h 排泄量则与对照组持平(P＞0.05),并且数据离散度小于PEDV-XS12 LD100(图5c—d)。 采食方面,该组平均采食量于攻毒后3 d 达到峰值(222.75 mL∕d)。 攻毒期间,受试动物仅在攻毒后2—3 d 分别出现死亡。 由于多数受试动物存活,因此平均24 h 排泄量在攻毒后7 d 达到峰值。

图5 仔猪PEDV-XS12 LD0 的体征指标Fig.5 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD0 of PEDV-XS12

截至试验结束,8 头仔猪存活。 据此,PEDV-XS12 LD0死亡时间为48—72 h,平均死亡时间为56.75 h。

2.3.3 PEDV-XS12 LD80对仔猪的影响

依据PEDV-XS12 LD100和PEDV-XS12 LD0的浓度,并结合组别计算出平均i=0.63,得到PEDV-XS12 LD80的合理浓度为126 copies∕mL、5 mL∕kg 的剂量,进一步判断 PEDV-XS12 LD80浓度。 口服攻毒后1 d,受试动物所有体征指标均升高,平均体重和平均体温直接达到峰值(图6b—c)。 攻毒后2 d,受试动物平均采食量达到峰值(120 mL∕d)。 至此,除平均24 h 排泄量以外,平均采食量、体重和体温均呈下降趋势(图6d),其中平均体温为37.9 ℃,较对照组下降0.6 ℃,较攻毒后1 d 平均体温下降1.1 ℃。 通过与PEDVXS12 LD100相关体征指标对比发现,两组的平均体重、体温均在攻毒后1 d 达到峰值,此后二者均呈下降趋势。 表明高浓度PEDV-XS12 的致病力可能与受试动物的体重与体温存在相关性。

图6 仔猪PEDV-XS12 LD80的体征指标Fig.6 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD80 of PEDV-XS12

截至试验结束,受试动物死亡6 头,PEDV-XS12 LD80死亡时间为96—120 h,平均死亡时间为118.2 h。

2.3.4 PEDV-XS12 LD60对仔猪的影响

通过i=0.63 所得出的PEDV-XS12 LD80死亡头数少于PEDV-XS12 LD100。 因此,继续通过相同的i算出 PEDV-XS12 LD60的合理浓度,即 79 copies∕mL、5 mL∕kg 的剂量,进而判断 PEDV-XS12 LD60的浓度。 口服攻毒后1 d,受试动物平均采食量迅速增加(P＜0.01),达到160 mL∕d(图7a),平均体重、体温均达到峰值(图7b—c),其中平均体温为37.6 ℃。 随后,受试动物平均采食量不断升高,并于攻毒后6 d 达到峰值(240 mL∕d)。

图7 仔猪PEDV-XS12 LD60的体征指标Fig.7 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD60 of PEDV-XS12

截至攻毒后7 d,共5 头受试动物死亡,PEDV-XS12 LD60死亡时间为33—106 h,平均死亡时间为60.1 h。

2.3.5 PEDV-XS12 LD40对仔猪的影响

通过i=0.63,计算出PEDV-XS12 LD40的合理浓度为50 copies∕mL、5 mL∕kg 的剂量,继续对受试动物口服攻毒,通过监测受试动物的采食量、体重、体温、24 h 排泄量、死亡头数体征指标,判断PEDV-XS12 LD40的剂量。 受试动物在口服攻毒前,各体征指标正常。 口服攻毒1 d 时,受试动物的平均采食量显著提高(160 mL∕d) (P＜0.01) (图8a)。 受试动物平均采食量在攻毒后 6 d 达到峰值(252 mL∕d),该指标与平均24 h 排泄量的趋势一致(呈正相关),与试验时间呈负相关(图8a—d)。 与之相反,平均体重与体温呈下降趋势,与试验时间呈负相关。

图8 仔猪PEDV-XS12 LD40的体征指标Fig.8 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD40 of PEDV-XS12

试验结束时,受试动物共死亡4 头,攻毒后平均48 h 进入临床明显期,PEDV-XS12 LD40死亡时间为42—130.5 h,平均死亡时间为73.1 h。2.3.6 PEDV-XS12 LD20对仔猪的影响

通过i=0.63,计算出 PEDV-XS12 LD20的合理浓度为31 copies∕mL、5 mL∕kg 的剂量。 对受试动物口服攻毒,最后判断PEDV-XS12 LD20的剂量。 攻毒48 h 内,受试动物的平均采食量基本持平(P＞0.05),在攻毒3 d 时达到峰值(211.43 mL∕d) (图9a—b)。 随后 4 d,平均采食量保持在 200 mL∕d。 攻毒期间,该组平均体重、体温趋势保持一致,与时间呈负相关。 平均24 h 排泄量与其余各组趋势基本一致,表明腹泻的程度可能与感染后受试动物的死亡时间有关。

图9 仔猪PEDV-XS12 LD20的体征指标Fig.9 Physiological parameters of piglets challenged with 1 dosage of LD20 of PEDV-XS12

试验结束时,共3 头受试动物死亡。

2.3.7 PEDV-XS12 LD50结果

各组受试动物死亡率分别是:LD100=10∕10、LD80=6∕10、LD60=5∕10、LD40=4∕10、LD20=3∕10、LD0=2∕10。 采用改进寇氏法和Bliss 法,将上述各组的死亡头数、总头数进行回归分析。 最终,得到PEDV-XS12 LD50为48.044 copies∕mL,95%置信区间为29.053—72.071,i=0.63。 该结果符合正态分布。

3 讨论

PED 作为一种高发病率、高死亡率的接触性肠道传染疾病[4],对我国大陆地区生猪养殖业造成巨大危害。 对妊娠母猪进行免疫,提高其泌乳期乳汁中特异性抗体的含量,增强哺乳仔猪被动免疫效果,方可控制PED 疫情。 然而,因受技术原理以及研制过程等多方面影响,新疫苗效果是未知的,临床应用前需要经过严格的动物模型来评价。 因当前没有PEDV 流行强毒株的LD50数据,尚无通用的PEDV 攻毒模型,这给新疫苗研制和评价造成技术障碍。

为了填补该研究的空白,本研究选用父本为杜洛克,母本为长白∕大白所繁育的3 d 未吃初乳的三元杂仔猪为实验动物,通过口服途径以5 mL∕kg 的PEDV-XS12 灌服,进行LD50模型的测定。 目前,我国大部分猪场均存在PEDV 感染的现象,感染原因除与生猪养殖密度高、养殖技术欠发达等有关外,PEDV 在临床上的致病力也是重要因素之一。 本试验结果表明,PEDV-XS12 只需要48 copies∕mL,5 mL∕kg 的剂量即可导致平均体重1.5 kg 的人工哺乳仔猪发病死亡过半,该结果间接反映出我国的PEDV 仍属于强流行毒株的范畴,提示饲养人员应全面加强母猪在妊娠后期的产房消毒工作。 腹泻是PED 的主要临床症状,在我国大陆地区,PED 患病猪只除符合PEDV 感染特点外,其体内往往含有其他肠道病毒,比如:TGEV、PDCoV 和PRV,形成符合感染。 因此,除平均排泄量指标外,本研究还对受试动物的平均采食量、体重、体温等进行24 h 动态监测。 在平均排泄量方面,用一定剂量(LD40、LD20、LD0)的PEDV-XS12 感染受试动物后,虽然试验周期内的排泄量总体下降,每日排泄量增加趋势缓慢,但不同剂量组间的平均排泄量却没有相关性,说明仅凭腹泻量单个指标并不能准确反映出患病猪只的感染程度和预后。 在临床中,采食量是饲养人员评判动物生理机能是否健康的主要标准之一,在发现动物采食量下降时,其疾病早已进入临床明显期,这对预防 PED 极为不利。 受试动物感染 PEDV-XS12 期间,采食量(LD80、LD60、LD40、LD20、LD0)远高于对照组,除了排泄量以外,其他指标均与PEDV-XS12 载量和时间呈负相关。 由于PEDV-XS12 主要侵袭小肠部位,受试动物仍有食欲,因此采食量与排泄量呈正相关。 本研究根据临床观察发现,体温是判断受试动物是否感染PEDV-XS12 的主要指标,再结合体重与粪便形态指标,可以准确判断出感染阶段是前驱期还是临床明显期,这对仔猪感染PED 后的临床判断具有重要的指导作用。

研究者从不同角度对LD50的测算方法进行设计与改进,截至目前,针对不同受试物质和受试对象,LD50的测算方法多达十几种[26,28-31]。 LD50的计算方法分为两类:一类是传统方法,比如霍恩氏法、寇氏法、改进寇氏法、Bliss 法等;另一类则是改进方法,比如UDP、FDP 等[32-33]。 尽管LD50测算方法经过几十年研究已有许多重要进展,但目前还无法提出一种任何条件下都能令人满意的方法。 因此,本研究首先采用UDP 对PEDV-XS12 LD100进行估算。 UDP 又被称为序贯法,是由Dixon 和Mood 于1948 年首次提出,后经Bruce 利用优选法对其进行了改进[34],即以受试动物死亡为目的,用最少的受试动物测算出LD100。 本试验首先针对受试动物随机设计多个剂量点,每次只攻毒1 头仔猪。 然后,根据攻毒后仔猪的反应决定下一个攻毒剂量。 若仔猪存活,攻毒剂量则提高,若仔猪出现死亡或濒死,攻毒剂量则降低。 最后,逐渐缩小病毒浓度范围,进行正式试验的验证。 在测算PEDV-XS12 LD0时,本研究采用FDP。 FDP 是1984 年由英国毒理协会提出的[35],与UDP 不同的是,该方法设有固定剂量和多个组别,并且不以受试动物死亡为目的,而是以攻毒后受试动物的毒性症状来判断受试物质的毒力。 FDP 分为预试验和正式试验两部分。本研究在预试验中,对PEDV-XS12 LD100病毒原液进行倍比稀释,各剂量组别分别攻毒1 头仔猪,并观察攻毒后仔猪发病症状,用以筛选出既有毒性又不死亡的候选剂量。 正式试验则用候选剂量对仔猪攻毒,每个候选剂量组有4 头仔猪,攻毒后7 d 内无仔猪死亡的剂量即为PEDV-XS12 LD0。

为了求出PEDV-XS12 对仔猪的 LD50,对其设置了4 个浓度组,并通过 PEDV-XS12 LD100和 PEDVXS12 LD0的病毒载量计算出i,即两组病毒载量之间的比值,并根据i调整各组攻毒剂量。 在分组方面,采用了改进寇氏法,即在试验设计中同时满足以下四种条件:最低剂量组的反应率≤20%,最高剂量组≥80%;反应率大致呈正态分布;剂量必须按等比级数分布;各组受试动物数量相等[36]。 最后,通过Bliss 法对攻毒7 d 后,各组仔猪总头数、仔猪存活头数和死亡头数进行回归分析,得到最终的PEDV-XS12 LD50为48.044 copies∕mL。 Bliss 法又称加权几率单位法,利用对数剂量与反应率的转换数呈直线关系而设计,通过对几率单位期望值的反复校正及加权处理,求出回归直线方程。 在众多LD50计算方法中,该方法最为精确、可靠,可以获得LD5—LD95全部参数[37-41];同时,该方法也是新药审批办法中所推荐使用的。