南四湖人工湿地沉积物中氨氧化细菌的筛选和鉴定

张念鑫,孔 勇,于君君,舒凤月,周 晶*,王庆峰,于国红

(1 曲阜师范大学生命科学学院,曲阜 273165;2 上海市农业科学院,上海 201403;3河北省农林科学院旱作农业研究所,衡水 053000)

湿地是陆生生态系统和水生生态系统的过度地带,是具有保护生物多样性、改善水质等功能的重要生态系统。 近年来由于人们对湿地生态系统的过度污染,造成了湿地面积锐减等严重的环境问题[1]。 作为中国南水北调东线工程重要输水通道的南四湖,其湿地生态系统的水质良好是确保南四湖水质安全及调水工程顺利实施的重要保证。 为了提高南四湖水质、恢复湿地生物多样性,南四湖流域开展了大规模的湿地修复工程,人工湿地的修建促进了水体净化和物质循环,其中氮元素的循环过程受到特别关注[2]。

氮素循环是生物地球化学循环中的重要环节之一,其循环过程主要包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用4 个过程,均由微生物驱动[3]。 硝化作用是固氮作用和反硝化作用之间的重要环节[4],进一步分为两个关键过程:第一阶段的氨氧化过程和第二阶段的硝化过程,其中氨氧化细菌参与的氨氧化反应是硝化反应的限速步骤。 自1890 年,Winogradsky 首次发现细菌的氨氧化作用以来,研究者对氨氧化细菌的作用机理和分离纯化方式十分关注。 氨氧化细菌的氨氧化作用包括2 个氧化过程[5],分别利用自身的氨单加氧酶(Ammonia Mono Oxygenase,AMO)和羟胺氧化酶(Hydroxylamine Oxidoreductase,HAO)进行反应[6],最终将氨氧化为亚硝酸盐。 氨氧化细菌属于革兰氏阴性专性化能自养细菌,由于其自身的依附性以及生长速率慢等特性,使得从环境中分离纯化氨氧化菌成为一大难题。 如今,最常用的方法是先将样品通过富集培养,再利用硅胶培养基和琼脂培养基分离纯化氨氧化菌。

目前,关于南四湖人工湿地微生物的研究相对较少,而对于氨氧化菌的研究更是微乎其微。 氨氧化细菌作为污水生物处理系统实现氨氮去除的主体,其种群结构组成和种群数量在一定程度上决定了南四湖水体中氮素的循环速率,进一步决定了南四湖水体的富营养程度。 本研究通过从南四湖人工湿地沉积物中分离出具有氨氮去除能力的细菌,以了解南四湖水质的现状,并为污染水体的生物修复提供初步候选菌种。

1 材料与方法

1.1 材料

富集培养基(SM):(NH4)2SO42.5 g,KH2PO40.35 g,MgSO4·7H2O 0.25 g,CaCl20.18 g,蒸馏水500 mL,pH 8.0。

分离培养基(BTB 培养基):(NH4)2SO42 g,K2HPO40.75 g,NaH2PO40.25 g,MgSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·4H2O 0.01 g,CaCO35 g,蒸馏水 1 L,pH 7.2。

营养补充液:(NH4)2SO45.5 g,蒸馏水100 mL。

硅胶分离培养基:在155 mL 蒸馏水中加入5.5 mL 相对密度为1.84 的浓硫酸,在185 mL 蒸馏水中加入22 mL 相对密度为1.19 的浓盐酸,两者混合即为稀酸液。 在500 mL 蒸馏水中加入82.59 g 硅酸钠,搅拌溶解即为水玻璃。 提取12 mL 水玻璃和8 mL 稀酸液于烧杯中,快速搅拌至均匀后,倒入培养皿中,静置60 min 凝固。 凝固后用蒸馏水轻轻冲洗5—8 次,每次15—25 min。 用1%的硝酸银溶液检查氯离子的去除效果,若呈白色则继续冲洗。 当氯离子除去后,用无菌水将硅胶平板冲洗1 次,倒置晒干[7]。 在硅胶平板表面加入2 mL 氨氧化菌分离培养液,然后放入烘箱中,35—45 ℃维持1.0—1.5 h 至表面无液体流动,然后与培养皿盖一同在紫外灯下照射30 min,即为用于分离氨氧化细菌的硅胶平板。

1.2 方法

1.2.1 样品采集

南四湖是微山湖、昭阳湖、独山湖、南阳湖的总称,为淮河流域第二大淡水湖。 其中微山湖面积最大,故又统称为微山湖。 湖泊北高南低,南北长约125 km,东西宽5.6—30 km,湖区面积1 225 km2,储水量19.3 亿m3。 随着人为活动的影响,导致南四湖生态环境恶化,富营养化和沼泽化状况严重。 2005 年3 月,位于南四湖新薛河的人工湿地示范区建设工程正式启动,使得南四湖的水质得到很大程度的改善。本研究采样地点位于山东省南四湖新薛河人工湿地,该地为暖温带、半湿润季风气候,年平均气温14.2 ℃,年降水量700 mm。 于2015 年9 月底采集薛河湿地滞留塘底泥,釆用“之”字形布点取样(图1),取样深度均为0—20 cm。 使用取泥器取同样深度的土样9 份,充分混合均匀后放入无菌袋中,每处理取4 个重复,封装后带回实验室,4 ℃冰箱保存。

图1 采样点Fig.1 Schematic diagram of sampling points

1.2.2 好氧氨氧化菌的分离筛选

将采集的底泥以每10 mL 添加1 g 底泥的比例加入富集培养基中,置28 ℃恒温室中培养10—15 d。用格利斯试剂在白瓷板上检测亚硝酸的生成情况[8]。 格利斯试剂检验为红色的富集液中加入1 mL 营养补充液,继续恒温培养。 再次检验,当检验结果呈现深红色时,吸取1 mL 富集液移至新鲜培养液中恒温培养。 连续2 次营养补充和移液富集后,吸取0.05 mL 富集液于硅胶平板上28 ℃培养2—4 周,挑取针尖大小的单菌落于琼脂平板上划线分离,在28 ℃恒温室中培养。 重复划线分离,纯化细菌。

1.2.3 16S rDNA 序列扩增

采用爱思进生物科技有限公司AxyPrep 细菌基因组DNA 小量制备试剂盒抽提细菌基因组DNA,并用DNA 纯化试剂盒纯化DNA 样品。 以纯化后的DNA 为模板进行16S rDNA 靶标基因的扩增,引物采用通用引物 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Escherichia coli对应位置为 8—27) 和 1541R:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。 PCR 扩增程序:95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 40 s,33 个循环;72 ℃ 8 min。 PCR 扩增后的产物,电泳检测片段大小合格后,进行切胶回收,用天根生化公司的DNA 纯化回收试剂盒对扩增产物进行纯化。 将纯化产物送上海生工生物科技有限公司测序。 将测序后的序列导入NCBI 数据库,进行比对,寻找亲缘关系相近的菌种,并用MEGA 6.1 软件采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株形态特征

对底泥经过2 次的富集培养后,通过纯化分离获得5 株氨氧化细菌。 在培养过程中发现该细菌能在氨氧化菌富集培养基和琼脂平板上生长,表明菌株的营养来源方式多样,适应能力强。 在琼脂平板上,菌落呈半透明浅灰白色,表面湿润光滑,微隆起,边缘整齐(图2)。 经革兰氏染色后,置油镜下观察,5 株菌均呈现出红色,均为革兰氏阴性菌。

图2 各菌株的菌落形态Fig.2 Colony morphology pictures of each strain

2.2 16S rDNA 序列的系统进化树构建

通过NCBI 的Bastln 检索系统进行基因序列同源性分析,16S rDNA 序列同源性比对结果(图3)发现,筛选分离出的5 株菌中,分别与异氧硝化菌(3 号和11 号)、嗜酸菌(5 号)、酯香微杆菌(4 号和12 号)亲缘关系较近。 进化树分析发现,分离筛选出的异氧硝化菌(3 号和 11 号) 与亚硝基滞氮杆菌(Diaphorobacter nitroreducens)、多羟基丁酸正交杆菌(Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans)和风湿杆菌(Diaphorobacter oryzae)聚为一簇,进一步与亚硝基滞氮杆菌(Diaphorobacter nitroreducens)、多羟基丁酸正交杆菌(Diaphorobacter polyhydroxybutyrativorans)聚为一小簇。 说明3 号和11 号菌株都与Diaphorobacter属细菌的亲缘关系最近。 该属的细菌对含苯环的物质具有一定的降解作用,且具有一定的絮凝作用,有较强的环境和工业应用价值。 异养硝化-好氧反硝化作用是Diaphorobacter 属的主要脱氮形式,将硝氮、亚硝氮、氨氮转化并加以利用进行菌体生长,可促进污染水体的氮循环[9]。 酯香微杆菌(4 号和11 号)与苏氏微杆菌(Microbacterium suwonense)、酮侧体微杆菌(Microbacterium ketosireducens)、解阿拉伯半乳聚糖微杆菌(Microbacterium arabinogalactanolyticum)聚为一簇,其中与解阿拉伯半乳聚糖微杆菌(Microbacterium arabinogalactanolyticum)的进化关系最为接近。 说明4 号和12 号与Microbacterium属具有高度相似性,此属细菌常发现于乳制品、污水和昆虫等。Microbacterium在自然界中广泛存在,具有极强抗逆性,是修复环境污染的理想微生物。 可修复受油污染的地表水、脱除有机硫,以及降解有机污染物[10]。 嗜酸菌(5 号)与缬草酸卵菌(Acidovorax valerianellae)、西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli) 和沃氏食酸菌(Acidovorax wautersii)聚为一簇,说明5 号与Acidovorax 属细菌具有高度的相似性,该属细菌属于好氧或兼性厌氧非发酵革兰氏阴性杆菌。 嗜酸菌是极端环境微生物的主要类群之一,生长在酸性环境,这是由于硫或硫化物的存在及氧化,嗜酸菌在地球物质循环方面做出了重要贡献[11]。 可以看出,整个进化树将嗜酸菌属(Acidovoraxsp.)、微杆菌属(Microbacteriumsp.)、Diaphorobacter 属分为 3 簇。

图3 16S rDNA 序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequences

3 结论与讨论

近几十年来,以无机或有机物作为氮源的异养硝化微生物(包括细菌、放线菌、真菌)相继在土壤、污泥、湖水、深海火山口等处被发现和分离[9]。 和大多数自养硝化细菌相比,异养型硝化菌生长速率快、细胞产量高并且能忍受酸性较强的环境,虽然至今对异氧硝化菌的代谢途径不甚了解,但其仍具有一定的硝化性能。 异氧硝化菌能够利用有机碳生长,并将含氮化合物硝化成亚硝酸盐、硝酸盐等产物[10],在人工湿地的氮循环过程中十分重要。

通过对5 株菌的16S rDNA 序列和进化树分析发现,3 号与11 号属于Diaphorobacter属,该菌属在对数生长期菌体增长迅速的同时去除氨氮的效率增高。 在氨氮浓度较低时菌体生长会进入稳定期,在菌体生长过程中会检测到少量的硝氮和亚硝氮这是由于菌体发生了异养硝化,但在氨氮浓度偏低时会将这些副产物消耗掉。 而且Diaphorobacter属细菌在脱氮促进氮素循环的同时,还可降解苯酚类有机物,苯酚对人体和动植物均有毒害作用。 因此,3 号和11 号可作为较好的候选生物修复菌株。

本研究主要是为了筛选具有氨氮去除能力的细菌,用于促进人工湿地污水净化中的氮素循环。 人工湿地是指将污水有控制的投配到经人工建造的湿地上,污水在沿一定方向流动的过程中,通过土壤、植物、微生物、人工基质等作用,对其自身进行一定程度的净化技术[12]。 在污水被净化的过程中,氮元素的去除主要通过氨化、硝化、反硝化、植物吸收和基质吸附等途径[13]。 南四湖在南水北调东线建设中具有重要地位,其水质对南水北调的整体质量影响较大[14]。 在5 株氨氧化菌的筛选培养过程中,本研究选用氨氧化菌富集培养基和琼脂平板对其进行分离纯化,结果表明5 株氨氧化菌均能够利用无机氮和有机氮进行生长,其营养来源多样,能够适应南四湖人工湿地的复杂环境,促进氮素循环净化水质。