江苏猪附红细胞体16S rRNA 基因的序列测定及系统进化分析

夏 叶,孙莹慧,李春华,郭佳宏,王秀花,缪德年*

(1 上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海 201106;2 上海市农业科学院上海种猪工程技术研究中心,上海 201106)

附红细胞体病(Eperythrozoonosis)是由寄生于红细胞表面、血浆及骨髓内的附红细胞体导致的一种人兽共患病[1],可造成动物贫血,生长迟缓,肉、乳产量降低,繁殖能力下降等,还会诱发呼吸道和肠道等多种疾病,严重者甚至死亡[2-3]。 附红细胞体不能体外培养,无法研制疫苗,目前该病尚无很好的防控方法,一旦在猪场大规模传播,很难得到及时控制。 近年来,附红细胞体病在猪场的检出率逐年增高,给畜牧业带来很大经济损失。 猪体感染后,常呈隐性状态,在抵抗力降低或应激状态下发病,通常与其他疾病混合感染或继发感染。 急性感染的猪体会产生高热、呼吸抑制、眼周分泌物旺盛等症状,全身皮肤出现发红或苍白;慢性感染的猪体临床症状不明显,主要表现为孱弱、消瘦[4-5]。 本研究对江苏省南通地区猪附红细胞体流行毒株的变异情况进行分析,以期为猪附红细胞体病的有效防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

以南通地区某养猪场自然感染猪附红细胞体的2 头猪(姬姆萨染色镜检诊断为附红细胞体阳性)为试验对象。

1.2 主要试剂

DNA 提取试剂盒、高保真聚合酶Prime STAR HS DNA、DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司,DL2000 DNA Marker 购于北京全式金生物技术有限公司。

1.3 16S rRNA 基因的扩增

根据GenBank 中公布的猪附红细胞体16S rRNA 基因核苷酸序列,利用Primer Premier 5.0 软件设计1 对 特 异 性 引 物, 上 游 引 物 F: 5 ’-CCGAAAGTCTGATGGAGCAATA-3 ’; 下 游 引 物 R: 5 ’-ATCTCAAGACACGAGCTGACGAC-3’,预计扩增片段大小为695 bp,引物由铂尚生物科技(上海)有限公司合成。

采集病猪血液,按照DNA 提取试剂盒说明书提取猪附红细胞体基因组DNA,进行PCR 扩增。 PCR反应程序:98 ℃预变性2 min;98 ℃变性10 s,55 ℃退火10 s,72 ℃延伸1 min,30 个循环;72 ℃延伸10 min。 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,割胶回收目的片段,送铂尚生物科技(上海)有限公司测序。

1.4 序列比对和遗传进化分析

采用DNAStar 软件对获得的猪附红细胞体16S rRNA 基因序列与国内外已发表的具有代表性的猪附红细胞体16S rRNA 基因序列进行比较(表1)。 利用MEGA 5.10 软件构建进化树,进行系统进化分析。

表1 猪附红细胞体16S rRNA 基因来源Table 1 Sources of Eperythrozoon suis 16S rRNA gene

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增结果

将2 份血液样品的基因组DNA 进行PCR 扩增,扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测,发现16S rRNA 基因的片段大小为695 bp 左右(图1)。

图1 猪附红细胞体16S rRNA 基因的PCR 扩增Fig.1 PCR amplification of Eperythrozoon suis 16S rRNA gene

2.2 16S rRNA 基因序列分析

测序结果表明,分离株PE1 和PE2 中扩增得到的猪附红细胞体16S rRNA 基因序列长度分别为695 bp 和672 bp。 图2 显示,分离株PE1 和PE2 的16S rRNA 基因核酸序列同源性为76.4%。

图2 猪附红细胞体16S rRNA 基因核苷酸序列的同源性分析Fig.2 Homology analysis of nucleotide sequence of Eperythrozoon suis 16S rRNA gene

2.3 系统发育进化分析

由图3 可知,分离株PE1 与 PE2 的亲缘关系较远。 分离株 PE1 与中国猪细小支原体分离株 ZJ JX9330 以及日本猪细小支原体分离株Morioka4、Morioka9 亲缘性关系最近;分离株PE2 与意大利绿念珠菌支原体分离株398∕09C 亲缘性关系最近。

图3 猪附红细胞体16S rRNA 基因核苷酸序列系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of Eperythrozoon suis 16S rRNA gene

3 讨论

自1972 年我国江苏发生第1 例猪附红细胞体病后,目前已在山东、云南、广东、内蒙、湖北、新疆、安徽和北京等二十多个省市相继出现了该病的报道[6-9]。 临床上,猪附红细胞体病通常与猪瘟、猪链球菌病、蓝耳病、副猪嗜血杆菌病等混合发生或继发感染。

附红细胞体的感染途径多样,猪体可通过摄食污染的含血物质、接触污染器械或昆虫传播等方式感染附红细胞体;也可通过母婴垂直传播方式感染[10]。 附红细胞体可以存活于无感染症状的动物体内,在动物体遭遇应激、长途运输、饲养管理不良或其他病原体刺激时发病[10],这类亚临床感染的动物被认为是附红细胞体的主要寄存宿主。 猪附红细胞体病在各个季节均可发生,其中夏季感染率最高,春秋两季次之,冬季较低[8]。 不同生长阶段的猪体均能感染,哺乳仔猪和断奶仔猪感染率最高,种母猪和育肥猪略低[8]。 抗血液原虫药物、抗生素类药物等对猪附红细胞体具有较好的杀灭作用,有研究表明,盐酸多西环素疗效最佳,可作为治疗猪附红细胞体病的首选药物[11]。 近年来,非洲猪瘟肆虐,对我国的生猪养殖业造成了重大影响,而附红细胞体感染会降低猪体免疫力,导致猪体感染非洲猪瘟的几率增大。 因此,对附红细胞体病进行监测和防控不仅是为了控制该病原本身,更是为整个生猪养殖业的健康发展保驾护航。

本研究从南通地区猪场得到的分离株PE1 与中国分离株、日本分离株位于同一分支,亲缘关系最近,提示该分离株可能来自中国或日本;分离株PE2 与意大利分离株位于同一分支,亲缘关系最近,提示该分离株与意大利株可能源于共同的祖先。 综上,南通地区的猪附红细胞体分离株来源复杂,包括东亚乃至欧洲,这可能与长三角地区贸易发达有关。 鉴于近年来生猪养殖业形势严峻,猪附红细胞体病对猪的生产性能影响显著,并可能引起严重的继发感染,因此,需对猪附红细胞体进行有效地监测和防控,以助力生猪养殖业的快速恢复和可持续发展。