猪ALAS1 基因内含子9 多态性检测及其对繁殖性能指标的遗传效应

吴华莉,曹建国,张莺莺,王洪洋,涂尾龙,黄 济,谈永松

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海 201106;上海市种猪工程技术研究中心,上海 201302)

提高猪繁殖力一直是生猪养殖者追求的目标,国内外育种工作者不断寻找可用于提高猪繁殖性能的遗传标记。 5-氨基乙酰丙酸合成酶1(5-aminolevulinate synthase 1,ALAS1)是体内血红素合成的第一限制酶[1]。 生物体内多种细胞都需要血红素(heme),其功能是参与红细胞成熟,在生物体内进行氧气运输、电荷传递,它作为一种重要的信号分子参与众多的分子和细胞过程[2-4]。 人、小鼠和鸡ALAS1 基因已经被克隆出来,该基因含有11 个外显子和10 内含子[5-7]。 小鼠ALAS1 基因也称ALAS-N。 小鼠ALAS1 基因被证实在卵泡发育和排卵过程中起作用[8]。 刘林清等检测猪ALAS1 基因内含子9 存在MSPⅠ酶切位点,CC型的产仔数高于TT 型的产仔数[9]。 猪ALAS1 基因在卵泡的发育、排卵及黄体化过程发挥一定作用[10-11]。本研究检测ALAS1 基因内含子9 在上海地区4 个猪种群体内的多态性,并分析该突变位点与长白猪和大白猪繁殖性状的相关性,以期为该突变位点用于猪繁殖育种提供基础数据参考。

1 材料与方法

1.1 动物样品和试验材料

4 个猪种的样品包括杜洛克猪(94 头),大白猪(144 头)和长白猪(78 头)来自上海祥欣畜禽有限公司,梅山猪(117 头)来自于上海猪状元牧场,共计433 头。 采集猪耳组织块,放在预先加有75%酒精的1.5 mL 离心管中,储存在冰盒里尽快运回实验室,放置-20 ℃冰箱保存备用。 AXYGEN 组织DNA 提取试剂盒购自上海轩略科技发展有限公司;PCR 引物由上海生工生物工程公司合成;PCR 试验所用试剂、DL 2000 DNA Marker 和MSPⅠ购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 组织中DNA 提取

按照AXYGEN 组织DNA 提取试剂盒的操作步骤,提取采集猪耳组织样品中的基因组DNA,测定DNA 浓度,将组织样品中的DNA 浓度统一稀释至50.0ng∕mL,放置在-20 ℃冰箱内保存备用。

1.2.2 PCR 扩增所用引物及扩增条件

上游引物:5’-CACACCCCGCAGATGATGAC-3’; 下游引物:5’-AAATAGAAGTGCAGAGCCCAGC-3’[9]。 将所有样品分20 组进行试验,每组包含约24 个样品,在1.5 mL 离心管内配置24 个样品的反应体系为:2 × Taq PCR Master Mix 264.0 μL,上下游引物各 12.0 μL,RNase-Free ddH2O 168.0 μL 。 颠倒离心管上下混匀,将离心管放入离心机中,设置离心转速为8 000 r∕min,离心1min,取0.2 mL 的PCR 8 联管进行分装,每管分装19.0 μL 的混合液,根据猪耳组织的编号在8 联管的管壁标记号码,然后加入对应样品编号的DNA 模板1.0 μL,使每个PCR 管内试验反应的总体积为20.0 μL。 PCR 扩增条件如下:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共30 个循环;72 ℃延伸5 min。 待PCR 反应结束后,将PCR 8 联管放入4℃冰箱内保存,配置1.0%琼脂糖凝胶,加入PCR 扩增产物,采用110 V 电压的,电泳时间为15 min,将凝胶从电泳液中取出,放置在凝胶成像分析系统中拍照保存图片。

1.2.3 PCR-RFLP 试验

PCR 扩增产物经琼脂糖电泳检测目的条带单一明亮的样品,可以进行酶切反应试验,酶切反应体系:PCR 产物 5.0 μL,10 × Buffer 2.0 μL,MSPⅠ0.5 μL,ddH2O 8.5 μL,总体积为 16.0 μL。 放入 37 ℃水浴中,酶切30 min 后进行琼脂糖凝胶检测。

1.3 基因型分析

PCR 预期扩增片段大小为359 bp。 酶切后产生3 种基因型:CC 型(277 bp,47 bp 和35 bp);TT 型(324 bp 和 35 bp);CT 型(324 bp,277 bp,47 bp 和 35 bp)。

1.4 统计分析

利用Excel 2010 统计分型结果,计算ALAS1 基因在4 个猪种群体的基因型频率和基因频率,并进行Hardy-Weinberg 平衡检验。。 采用SPSS 19.0 软件进行猪ALAS1 基因不同基因型的TNB 和NBA 差异比较分析。Yijk=μ+gk+eijk,μ为群体均值,gk为基因效应,eijk为随机残差。 采用GENEPOP 3.1 软件计算基因杂合度(Heterozygosity,He)、纯合度(Homozygosity,Ho)、有效等位基因数(effective number of alleles,Ne)和多态信息含量(polymorphism information content,PIC)。

2 结果与分析

2.1 检测猪ALAS1 基因PCR 扩增结果

采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增的结果,PCR 产物条带大小为359 bp,结果如图1 所示。 检测采集所有样品猪ALAS1 基因的扩增结果,PCR 产物均得到单一目的条带,符合后续酶切试验的要求。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测猪ALAS1 基因PCR扩增结果Fig.1 Agarose detection of swine ALAS1 gene by PCR amplification

2.2 PCR-RFLP 检测结果

PCR 产物按照PCR-RFLP 反应体系进行酶切试验,采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切试验的结果。由于琼脂糖凝胶电泳时45 bp 和35 bp 条带较小,电泳检测时无法显示出来。 酶切试验的检测结果如图2所示:TT 型显示出324 bp 一条带,CC 型显示出277 bp 一条带,CT 型显示出324 bp 和277 bp 两条带。 检测4 个猪种群体全部样品的PCR-RFLP 结果,根据琼脂糖凝胶电泳检测结果统计样品的个体基因型。

图2 猪ALAS1 基因RFLP-PCR 琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RFLP-PCR of pig ALAS1 gene

2.3 ALAS1 基因在4 个猪种群体内的基因型频率和基因频率统计结果

根据PCR-RFLP 检测结果统计4 个猪种群体的所有个体基因型,并计算ALAS1 基因在4 个猪种群体内的基因型频率和基因频率。 由表1 可见,ALAS1 基因在杜洛克猪、长白猪、大白猪和梅山猪群体内各基因型分布情况不同。 在杜洛克猪群体内只检测出TT 型;在长白猪群体内TT 型最多,CT 型较少,仅检测出一个CC 型;在大白猪群体内TT 和CT 中度分布,CC 型较少;在梅山猪群体内中CC 型最多,CT 型次之,TT 型最少。 在基因频率方面,除了在梅山猪群体内C 等位基因比例较高,在其他3 个猪群体内T 等位基因比例高。

表1 ALAS1 基因在4 个猪种群体内的基因型频率和基因频率Table 1 Genotype and gene frequency of ALAS1 gene in four pig populations

2.4 ALAS1 基因的遗传多态性分析

ALAS1 基因在杜洛克猪、长白猪、大白猪和梅山猪群体内的遗传多样性见表2。 大白猪和梅山猪的PIC 值为0.25—0.5,表现为中度多态;杜洛克和长白猪的PIC 值低于0.25,表现为低度多态。

表2 ALAS1 基因的遗传多态性分析Table 2 Genetic polymorphism analysis of ALAS1 gene

2.5 ALAS1 基因不同基因型在3 个猪种群体的TNB 和NBA 比较分析

ALAS1 基因在杜洛克猪群体内只检测出1 种TT 基因型,TT 型的TNB 和NBA 平均值分别为9.49 头和 8.43 头(表 3)。

表3 ALAS1 基因在杜洛克猪群体的TNB 和NBA 平均值(±SD)Table 3 TNB and NBA mean value of ALAS1 gene in Duroc populations 头

表3 ALAS1 基因在杜洛克猪群体的TNB 和NBA 平均值(±SD)Table 3 TNB and NBA mean value of ALAS1 gene in Duroc populations 头

基因型 TNB NBA TT 9.49 ± 0.65 8.43 ± 0.66

由表4 可见,ALAS1 基因在长白猪群体内 CT 型的 TNB、NBA 比TT 型的分别高0.23 头(P＞0.05)、0.29 头(P＞0.05)。 由于在长白猪群体内只检测出1 个CC 型,无法统计TNB 和NBA 值,无法与CT 型、TT 型TNB 和NBA 进行比较分析,因此数值未列出。

表4 ALAS1 基因不同基因型在长白猪群体TNB 和NBA 的数值(±SD)Table 4 TNB and NBA values of different genotypes of ALAS1 gene in Landrace populations 头

表4 ALAS1 基因不同基因型在长白猪群体TNB 和NBA 的数值(±SD)Table 4 TNB and NBA values of different genotypes of ALAS1 gene in Landrace populations 头

注:未标注表示差异不显著(P ＞0.05)。

基因型 TNB NBA CT 12.21 ± 0.60 11.25 ± 0.50 TT 11.98 ± 0.75 10.96 ± 0.57

由表5 可见,ALAS1 基因在大白猪群体内的TNB 和NBA 均表现为CC ＞CT ＞TT 趋势。 在大白猪群体内 CC 型的 TNB、NBA 比 CT 型的分别高 0.28 头(P＞ 0.05)和 0.24 头(P＞ 0.05);CC 型的 TNB、NBA 比TT 型的分别高1.63 头和 1.58 头(P＜ 0.01);CT 型的 TNB、NBA 比 TT 型的分别高 1.35 头和 1.34 头(P＜0.01)。

表5 ALAS1 基因不同基因型在大白猪群体TNB 和NBA 的数值(±SD)Table 5 TNB and NBA values of different genotypes of ALAS1 gene in Large White populations 头

表5 ALAS1 基因不同基因型在大白猪群体TNB 和NBA 的数值(±SD)Table 5 TNB and NBA values of different genotypes of ALAS1 gene in Large White populations 头

注:同列大写字母不同表示差异极显著(P ＜0.01),相同表示差异不显著(P ＞0.05)。

基因型 TNB NBA CC 12.80 ± 0.67 A 11.80 ± 0.82 A CT 12.52 ± 0.98 A 11.56 ± 0.70 A TT 11.17 ± 0.58 B 10.22 ± 0.83 B

3 讨论与结论

在哺乳动物细胞中有广泛存在的ALAS1 和红细胞中特异表达的ALAS2(又命名为ALAS-E),两者属于同工酶,ALAS 是血红素合成的限速酶[1,12]。 人类和鼠ALAS1 基因已被证实在卵泡发育和排卵过程中发挥作用。 小鼠卵巢中注射HCG 试验表明,小鼠ALAS1 基因在注射0.5—2.0 h 表达量增加,在卵泡破裂12 h 表达量迅速下降[13]。 小鼠ALASl 基因5’侧翼序列存在2 个cAMP 应答元件CRE,它是cAMP 基础表达和刺激表达必需的,cAMP 调节信号转导通路在卵泡发育和黄体化过程中发挥作用[14]。 人类ALAS1 基因参与排卵过程有关的线粒体细胞色素P450、类固醇代谢和类固醇生成过程[15]。 猪ALAS1 基因在血清促性腺激素处理后,在卵泡发育2 h 和排卵过程12 h 期间表达量高,在卵泡黄体化的16—24 h 表达低。在大白猪群体内含子9 突变产生CC 型的产仔数高于TT 型的产仔数(P＜0.01)[11]。 本试验结果表明:猪ALAS1 基因在上海地区大白猪群体内CC 和CT 型的 TNB、NBA 均高于 TT 型的 TNB、NBA(P＜0.01),但CC 型的 TNB、NBA 与 CT 型的 TNB、NBA 差异未达到显著水平(P＞0.05)。 这一结果与刘林清等证实ALAS1 基因CC 型在大白猪群体内具有较高产仔数的结果是一致的[9,11]。

有研究表明,内含子突变可以影响基因功能,影响mRNA 剪接和稳定性,也会影响基因的表达量[16-17]。 有研究证实ALAS2 基因位于增强子区域GATA1 转录因子绑定位点的突变可使启动子失活,从而引起先天性铁幼粒细胞贫血症的发生[18-20]。 猪ALAS1 基因内含子9 突变位点影响猪产仔数的机制目前还不清楚。 本试验检测ALAS1 基因在杜洛克猪、大白猪和长白猪的TNB 和NBA 平均值对比结果发现:杜洛克猪群体TNB、NBA 均低于长白猪和大白猪的TNB 和NBA,这一结果与杜洛克猪检测群体内只存在TT 型是否相关,需要进一步研究。 在梅山猪群体内的CC 型频率较高(达到0.62),由于未有梅山猪群体的繁殖性状数据进行关联分析,CC 型的高比例是否与梅山猪高产仔数的遗传性能有关,仍需收集繁殖性状后进行相关分析加以证实。

本研究对ALAS1 基因内含子9 区域MSPⅠ酶切位点进行多态分析,确定在大白猪群体内CC 型为影响产仔数的优势基因型,后续研究可扩大检测品种,在不同品种进行验证,从而确定ALAS1 基因该位点突变是否可以用于更多品种的分子育种实践。