青蒿素对大鼠自体移植静脉桥内膜增生的影响

黄强信 周念 冯志强 韦懿桐

广西中医药大学第一附属医院胸心血管外科（南宁530023）

大隐静脉仍是冠状动脉旁路移植术（coronary artery bypass grafting，CABG）的常用血管桥［1］，然而，移植术后静脉桥再狭窄率较高，严重影响手术远期疗效［2］。术后大隐静脉桥通畅率是CABG 术后成功的关键，术后1年静脉桥通畅率为80% ～90%，术后10年下降至40% ～50%［3］。因此，如何改善静脉桥的中远期通畅性仍是目前国际研究热点。

冠脉搭桥术后血管桥再狭窄的病理生理基础依次是早期血小板血栓形成、中期内膜增厚以及晚期粥样硬化征［4］。合理应用抗凝药可防止早期血管桥狭窄，晚期避免冠心病的各类高危因素可延缓粥样硬化征象的再次出现，然而，术后中期如何抗平滑肌细胞增殖及内膜增厚的相关研究则有所欠缺，若能找到有效抗内膜增厚的临床方法，对抗冠脉搭桥术后中期血管桥再狭窄将具有积极的作用［5］。因此，血管桥再狭窄主要是血管平滑肌细胞（VSMCs）发生表型转化导致增殖及迁移［6-7］。研究表明［8］平滑肌22α（SM22α）蛋白是维持VSMCs 收缩表型所必需的一种重要细胞骨架相关蛋白，也是鉴定VSMCs 表型转化极为敏感的特异性标志物。近年研究不断发现，青蒿素及其衍生物药理活性广泛，是一种从黄花蒿中提取的倍半萜内酯类过氧化物类药物，具有安全、价格便宜、口服吸收良好等优点。对心律失常、心肌缺血、动脉粥样硬化等心血管疾病均有良好的改善作用［9-11］。其中，青蒿素可通过抑制VSMCs 表型从收缩表型向去分化表型转变，具有改善动脉粥样硬化进展的药理作用［12-13］，然而，在静脉桥是否有影响仍是未知。本研究拟通过大鼠自体静脉移植模型，探讨其对移植后静脉桥内膜增生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料青蒿素（meilunbio MB6836），兔抗SM22α多克隆抗体（Abcam 公司，ab14106），山羊抗小鼠IgG-HRP、RIPA 蛋白裂解液和BCA 蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司）。内参β-Actin（康成生物公司），免疫组化试剂盒（博士德公司），HE 染色试剂盒（南京建成生物技术有限公司），双目双人显微镜（新天医疗器械公司）及显微外科器械一套（宁波手术器械厂），Alpha View 成像系统（美国Protein Simple 公司）。健康雄性SD 大鼠32 只，体质量240 ～280 g，由广西医科大学实验动物中心提供。

1.2 动物模型的建立术前常规禁食，使用10%水合氯醛按300 mg/kg 腹腔注射麻醉，肝素钠（200 U/kg）尾静脉注射达肝素化。取颈部正中切口约2.5 cm，常规备皮、消毒及切开皮肤，逐层分离，暴露右颈外静脉，8/0 结扎其属支，离取0.8 ～1.0 cm 远心端主干，肝素钠盐水冲管腔及浸泡其中备用。于右侧气管旁、胸锁乳突肌下充分游离颈总动脉至分叉处，长约1.0 ～1.2 cm，尽量避免损伤气管旁小动脉分支及迷走神经，罂粟碱稀释液喷洒动脉表面。颈总动脉两端用无损伤血管夹阻断血流，中间离断，切除动脉约0.5 cm，肝素钠盐水冲洗管腔并清除血凝块。利用“cuff”管套管技术将切下颈外静脉吻合于颈总动脉，建立自体静脉移植的模型。术后当天青霉素400 KU/kg 肌肉注射，常规饲养。

1.3 动物模型分组及处理按电脑随机数法分成青蒿素治疗实验组和对照组，各分为静脉移植术后2 周和4 周时间点，每个时间点8 只。实验组和对照组分别在术前1 d 至取材时间给予青蒿素100 mg/（kg·d）、等体积生理盐水灌胃。因麻醉过量、切口感染、肠梗阻、其他原因而死亡或血管闭塞的大鼠不列入后续研究。

1.4 静脉桥标本的采集及处理在术后2 周和4周沿原切口找到静脉桥，充分分离并取下静脉桥，肝素钠盐水冲洗干净，一部分用4%多聚甲醛液固定，备行HE 染色与免疫组织化学检测，另一部分保存于液氮罐备行Western bolt 检测。

1.5 病理形态学及免疫组化染色血管桥标本用4%多聚甲醛液固定后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制成蜡块，切片用常规苏木精-伊红染色（HE染色），采用计算机图像分析软件（Image-Pro Plus 6.0）测量血管中段横截面新生内膜厚度，每个标本随机取5 处不连续的位置测量，计算平均厚度。石蜡切片常规脱蜡，3%过氧化氢室温孵育5 min，微波炉抗原修复，5%～10%正常山羊血清封闭，滴加一抗兔抗SM22α 多克隆抗体（工作浓度1∶100），4 ℃冰箱过夜。滴加生物素标记二抗工作液，37 ℃孵育15 min。滴加SABC 复合物37 ℃孵育15 min。DAB 显色，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封闭固定后行光镜检查，光镜下平滑肌胞质内见淡黄至棕黄色颗粒为SM22α 阳性细胞，散在淡棕黄色为弱阳性，无棕黄色为阴性。

1.6 静脉桥组织SM22α蛋白表达的测定取静脉桥血管组织约5 mg，加入RIPA 蛋白裂解液60 μL和PMSF1 μL 进行总蛋白的提取，BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定样本蛋白的浓度。蛋白于12%SDS-聚丙酰胺凝胶电泳90 min，湿法电转50 min 转至聚偏氟乙烯（PDVF）膜后，剪出目的条带，6%脱脂奶封闭1.5 h，加兔抗SM22α 多克隆抗体（1∶1 000）进行抗体结合，4 ℃过夜，TBST 洗膜后加山羊抗小鼠IgG-HRP（1∶1 000）室温下孵育1 h，TBST 洗膜后滴加ECL 发光混合液在Alpha View 成像系统中显影。以β-Actin（1∶1 000）为内参抗体。图像用成像系统中的Multiplex Band Analysis 软件进行蛋白条带的灰度值分析；以SM22α 蛋白与β-Actin 蛋白条带的灰度积分比值来代表目的蛋白的相对表达量来分析结果。

1.7 统计学方法采用SPSS 17.0 统计软件，实验数据以均数±标准差表示。两组间比较用t检验，多组用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型建立及静脉桥通畅情况32 只SD大鼠手术均成功，均符合实验要求，术中、术后见静脉桥充盈良好。术后2 周、4 周静脉桥血管均不同程度的膨胀增粗及小血管增生。剪断静脉桥远端动脉，可见血液喷出，证实静脉桥通畅。

2.2 组织形态学改变HE 染色结果示，光镜下术后2 周内皮细胞排列紊乱及平滑肌细胞增生明显，4 周比较明显，经青蒿素治疗2 周和4 周后新生内膜与同期对照组相比：内膜相对完整，内皮细胞和平滑肌细胞明显减少，内膜的厚度与同期相比明显显著减少。差异均有统计学意义（图1 和表1）。

图1 两组血管内膜增厚情况（HE 染色，×200）Fig.1 Intimal hyperplasia in two groups（HE stained，×200）

表1 实验组与对照组内膜增生厚度的比较Tab.1 Comparion of intima thickness between treatment group and control group ±s

表1 实验组与对照组内膜增生厚度的比较Tab.1 Comparion of intima thickness between treatment group and control group ±s

注：与同期对照组新生内膜厚度比较，aP＜0.01

组别数量（只）平均内膜厚度（μm）实验组2 周对照组2 周实验组4 周对照组4 周8 8 8 8 20.79±1.88a 35.23±2.66 37.06±2.22a 46.23±2.54

2.3 免疫组织化学染色结果镜下可见静脉桥组织平滑肌细胞胞质呈棕黄色，即SM22α 蛋白表达阳性，其他区域无棕黄色或呈稀疏淡棕色，即SM22α 蛋白表达阴性或弱阳性（图2）。结果显示，经青蒿素治疗后2 周和4 周静脉桥组织中SM22α蛋白表达阳性率与同期对照组相比，对照组下降显著［（59.20±5.76）vs.（26.12±3.72），P＜0.01；（35.63 ± 4.36）vs.（10.38 ± 2.98），P＜0.01］，差异均有统计学意义。

图2 SM22α 蛋白在静脉桥的表达变化（免疫组化，×200）Fig.2 Changes of SM22α protein expression in graft veins（Immunohistochemistry，×200）

2.4 Western blot 结果用Western blot 方法检测移植静脉桥组织中SM22α 蛋白表达，结果显示，经青蒿素治疗后2 周和4 周静脉桥组织中SM22α 蛋白含量（SM22α/β-Actin）与同期对照组相比，对照组下降显著［（0.58±0.1）vs.（0.39±0.06），P＜0.01；（0.42 ± 0.06）vs.（0.21 ± 0.05），P＜0.01］，差异均有统计学意义。见图3。

图3 SM22α 蛋白在静脉桥组织的相对表达量变化情况Fig.3 The relative expression of SM22α protein in graft veins

3 讨论

静脉桥血管再狭窄的发生、发展是多因素、多因子共同参与的结果，包括早期的内皮损伤、血栓形成、再内皮化、静脉桥血管的动脉化，中期的内膜增生以及晚期的粥样硬化及斑块破裂等［14-15］。研究表明［4，16］，在手术创伤、移植静脉缺血及再灌注性损伤、静脉血流动力学改变等诸多因素的刺激下，移植血管打破正常生长调控机制，血管壁细胞增殖与凋亡调控失衡，促进血管内膜重塑，新生内膜发生增生、增厚最终导致了再狭窄，而血管平滑肌细胞的增殖、迁移是其中的关键病理过程。

本实验结果显示，在自体静脉移植术后2 周，实验组和对照组均出现平滑肌细胞大量增殖并且向内膜下迁移及内皮细胞排列紊乱至新生内膜增厚，术后4 周更为显著；但实验组与同期对照组相比，新生内膜厚度明显减少。这说明，实验组静脉桥再狭窄的程度轻。

VSMCs 在成人血管中表现为成熟的分化表型（收缩表型），常常表达一组独特的收缩功能蛋白为主如SM22α、平滑肌肌动蛋白α（α 平滑肌）、平滑肌肌球蛋白重链（SMMHC）、钙调节蛋白（calponin）等，表现为极低的增殖迁移、低成活性［17］。其中，SM22α 蛋白是一种收缩型VSMCs 标志物，参与收缩信号转导的调节，过表达SM22α 可干扰PDGF-BB 诱导的Ras-Raf-1 信号转导复合物的形成，阻断MEK1/2-ERK1/2 增殖信号级联的激活；进而抑制VSMCs 增殖、迁移和内膜增生［18-20］。然而，SM22α-/-Apo E-/-小鼠的VSMCs 增殖迁移能力增加，动脉粥样硬化病变进展更快［20］。因此，SM22α表达异常与平滑肌细胞异常增殖与迁移密切相关。近年的研究表明［12］，青蒿素可以抑制血管平滑肌的SM22α 表达下调，从而抑制VSMCs 表型转化，进而达到抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移和去分化的作用，从而减缓Apo E-/-小鼠动脉粥样硬化进展。

本研究发现，自体静脉移植术后静脉桥组织的平滑肌细胞的胞质有SM22α 表达。并且移植术后2 周后，与对照组相比，实验组静脉桥内膜增生明显减少的同时，组织中SM22α 蛋白表达也在抑制下调。这表明，SM22α 可能参与了静脉桥内膜增生的发生与发展这一复杂病理生理过程，而青蒿素能够抑制血管平滑肌细胞表型转化的作用，从而抑制平滑肌细胞异常增殖和（或）迁移，进而减轻静脉桥狭窄的发生，可能是产生这一效果的原因。具体的机制有待深入研究。

总之，本研究表明，青蒿素能抑制静脉桥SM22α的表达下调，进而减轻新生内膜厚度，对静脉桥狭窄的发生与发展有比较好的防治前景，但此实验样本量相对比较少，亦未进行细胞及其机制的探讨，仍需进一步深入研究。