脂肪干细胞联合右旋美托咪定对大鼠急性肾缺血再灌注损伤的保护作用

张建波 林楚妍 万丽 徐世元

1广州医科大学附属第二医院疼痛科（广州510260）；2南方医科大学珠江医院麻醉科（广州520280）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是临床常见的器官损伤，主要表现为肾小球滤过率（glomerular filtration rate，GFR）下降，引起血肌酐（serum creatinine，Scr）及尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的滞留升高。其中30%～40%的AKI 患者在围术期发生，其主要原因为肾缺血再灌注损伤，常见于血流动力学急剧变化的心血管等大手术及肾移植手术后［1］。

目前尚未找到可显著改善肾缺血再灌注损伤后AKI 生存预后的治疗方法。脂肪干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs）作为一种脂肪组织来源的间充质干细胞，具有促组织再生、抑制炎症、抗氧化应激、调节免疫等功能，近年来广泛用于器官保护研究领域。研究［2-3］报道，ADSCs 对肾缺血再灌注所致的AKI 发挥一定的器官保护作用。右旋美托咪定（Dexmedetomidine）作为一种α2 受体激动剂，是围手术期常用的镇静、镇痛药物，有研究报道其对多种器官缺血再灌注损伤包括对肾脏缺血再灌注损伤均具有一定的器官保护作用［4-5］。

在大鼠肾缺血再灌注损伤模型中，相对于单独使用右旋美托咪定或ADSCs，联合使用两种方法能否产生更强的肾脏保护作用尚不明确。本研究拟探究两者联合使用对大鼠急性肾缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及设备盐酸右旋美托咪定注射液（批号：15011432，江苏恒瑞制药公司）、肌酐测定试剂盒（Bio Assay Systems 公司）、尿素氮测定试剂盒（Bio Assay Systems 公司）等。动物手术台（上海康美医疗器械有限公司，中国）、普通光学显微镜（Nikon，日本）、倒置荧光显微镜（Nikon 公司）、共聚焦显微镜（Nikon 公司）、冰冻切片机（Leica 公司）等。

1.1.2 实验动物清洁级SD 雄性健康大鼠，11 ～12 周龄，体质量350 ～370 g。

1.2 实验方法

1.2.1 动物伦理本研究均遵守动物实验相关伦理及实验动物中心相关使用准则。

1.2.2 实验动物选择及分组健康成年雄性SD大鼠40 只，随机将其分为5 组，每组8 例。（1）空白对照组（Sham 组）：所有大鼠腹腔注射苯巴比妥钠50 mg/kg，待充分麻醉后，切开腹腔不做任何处理，于关腹后4 h，经尾静脉注射PBS 液1 mL。（2）缺血-再灌注组（IR 组）：麻醉后开腹将双侧肾蒂夹闭40 min，移除动脉夹后再灌注4 h 后，经尾静脉注射PBS液1 mL。（3）右旋美托咪定处理组（IR+DEX组）：腹腔注射右旋美托咪定25 μg/kg，30 min后，再按上述方法建立肾缺血-再灌注模型。（4）脂肪干细胞处理组（IR + ADSCs 组）：建立肾缺血-再灌注模型后4 h，经尾静脉注射ADSCs细胞悬液（1 mL的PBS液中含约1×106个ADSCs）。（5）ADSCs 联合右旋美托咪定组（IR + DEX +ADSCs 组）：腹腔注射右旋美托咪定25 μg/kg，30 min 后，将双侧肾动脉夹闭40 min，移除动脉夹再灌注4 h 后，经尾静脉注射ADSCs 细胞悬液。

1.2.3 缺血再灌注诱导AKI 模型的建立（1）取清洁级别，体质量350 ～370 g 雄性健康SD 大鼠，于术前6 h 禁食、不禁水；（2）大鼠麻醉后，开腹游离双肾，充分暴露双侧肾蒂，将无创动脉夹持续夹闭双侧肾蒂40 min，见肾脏缺血苍白或瘀血青紫为夹闭动脉有效标志。夹闭后将湿热的生理盐水纱布覆盖腹腔，置大鼠于37 ℃的恒温毯上保温，同时监测血压、呼吸指标；（3）40 min 后去除动脉血管夹，见肾脏由缺血苍白变红色为再灌注成功；（4）逐层缝合腹腔，术后继续置于37 ℃恒温毯上保温，苏醒后确定生命体征平稳置于笼中饲养。

1.2.4 肾功能检测在0、24、96 h，经各组大鼠眼眶后静脉丛取血液标本500 μL，按照肌酐及尿素氮试剂盒（Bio Assay systems，美国）说明书步骤，测量各组大鼠血清中两项指标浓度。同时收集各组大鼠0、24、96 h 时间点的尿液，分别检测各时间点尿液中尿蛋白与肌酐水平，并计算其比值（UP/UC）。

1.2.5 各组大鼠96 h 肾脏HE 染色组织病理学检查肾组织标本经组织固定、脱水、包埋、切片及染色后，采用盲法由病理科医生在光镜下对肾脏组织损伤进行评分。在200 倍光镜下，随机选取每个标本的10个不重叠视野，观察标本中肾小管坏死、管型形成、上皮细胞刷状缘脱落、肾小管扩张及肾间质出血水肿等情况，按损伤面积评分：正常未受损为0 分，损伤面积≤10%为1 分，11%～25%为2 分，26% ～45%为3 分，46% ～75%为4 分，≥76%为5 分。

1.3 统计学方法采用G*Power 软件对样本量估算，检验效能取0.8，估算大鼠试验前后血Scr 及BUN 两指标达到统计学差异（α 值取0.05 双侧检验）所需样本量。所有计量资料以（）表示，采用SPSS 20.0 统计软件分析。各组大鼠中计量资料的比较，采用重复测量的方差分析及单因素方差分析进行统计；肾脏组织损伤评分的等级资料，采用多个独立样本非参数检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾功能结果

2.1.1 各组在0、24、96 h肌酐结果不同时间血肌酐比较差异有统计学意义（F=2 277.5，P＜0.001），且时间因素和分组因素有交互作用（F=350.4，P＜0.001）；各组在三个时间点之间的血肌酐比较差异均有统计学意义（P＜0.001），见表1。

表1 各组在0、24、96 h 的血肌酐结果Tab.1 The level of serum creatinine at 0，24，96 h in each group ±s，mg/dL

表1 各组在0、24、96 h 的血肌酐结果Tab.1 The level of serum creatinine at 0，24，96 h in each group ±s，mg/dL

注：表中采用的“a，b，c，d”字母标记同一时间各组之间的差异，不同字母标记的组之间表示差异有统计学意义（P ＜0.05）；相同字母标记的各组之间，表示差异无统计学意义（P ＞0.05）。*表示重复测量方差分析中主体效应（时间）的F 值和P 值；“#”标示的分别为时间和组别间交互效应的F 值和P 值

分组Sham 组IR 组IR+DEX 组IR+ADSCs 组IR+DEX+ADSCs 组合计F 值P 值0 h 0.23±0.02 0.22±0.02 0.21±0.01 0.21±0.03 0.23±0.02 0.22±0.02 1.49 0.225 24 h 0.29±0.02a 3.61±0.27b 1.96±0.25c 1.71±0.15c 1.66±0.19c 1.84±1.08 567.9＜0.001 96 h 0.50±0.06a 3.94±0.18b 1.49±0.04c 1.41±0.06c 0.70±0.03d 1.61±1.25 1 093.3＜0.001 F 值111.3 1 267.5 293.9 1 020.4 344.2 2 277.5*350.4#P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001*＜0.001#

2.1.2 各组在0、24、96 h 血尿素氮结果不同时间点血尿素氮比较差异有统计学意义（F= 465.6，P＜0.001），且时间因素和分组因素有交互效应（F= 51.2，P＜0.001）；各组在三个时间点之间的血尿素氮比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组在0、24、96 h 的血尿素氮结果Tab.2 The level of serum BUN at 0，24，96 h in each group ±s，mg/dL

表2 各组在0、24、96 h 的血尿素氮结果Tab.2 The level of serum BUN at 0，24，96 h in each group ±s，mg/dL

注：表中采用的“a，b，c，d”字母标记同一时间各组之间的差异，不同字母标记的组之间表示有统计学差异（P ＜0.05）；相同字母标记的各组之间，表示无统计学差异（P ＞0.05）。“*“标示的分别为重复测量方差分析中主体效应（时间）的F 值和P 值；“#”标示的分别为时间和组别间交互效应的F 值和P 值

分组Sham 组IR 组IR+DEX 组IR+ADSCs 组IR+DEX+ADSCs 组合计F 值P 值0 h 13.9±1.47a 14.4±2.21a 15.1±2.02a 15.9±2.28a 16.4±2.65a 15.2±0.62 1.695 0.173 24 h 15.6±1.43a 82.6±9.89b 70.4±11.80c 69.6±14.10c 65.2±12.0c 60.7±25.70 46.553＜0.001 96 h 19.9±4.34a 106.0±15.5b 63.4±6.40c 49.6±15.20d 40.8±7.40d 56.0±30.85 70.199＜0.001 F 值8.202 212.877 189.282 76.983 79.234 465.6*51.2#P 值＜0.05＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001*＜0.001#

2.1.3 各组在0、24、96 h尿蛋白/肌酐比值结果各组主体效应（时间效应）差异有统计学意义（F=4163.2，P＜0.001），且时间因素和分组因素有交互作用（F= 547.2，P＜0.001）。Sham 组内不同时间点的尿蛋白/肌酐比值比较差异无统计学意义（P= 0.174），其余4 组不同时间尿蛋白/肌酐比值比较差异有统计学意义（P＜0.001）,见表3。

表3 各组在0、24、96 h 的尿蛋白/肌酐比值结果Tab.3 The level of urine protein/creatine at 0，24，96 h in each group ±s

表3 各组在0、24、96 h 的尿蛋白/肌酐比值结果Tab.3 The level of urine protein/creatine at 0，24，96 h in each group ±s

注：表中采用的“a，b，c，d”字母标记同一时间各组之间的差异，不同字母标记的组之间表示差异有统计学意义（P ＜0.05）；相同字母标记的各组之间，表示差异无统计学意义（P ＞0.05）。“*“标示的分别为重复测量方差分析中主体效应（时间）的F 值和P 值；“#”标示的分别为时间和组别间交互效应的F 值和P 值

分组Sham 组IR 组IR+DEX 组IR+ADSCs 组IR+DEX+ADSCs 组合计F 值P 值0 h 1.19±0.17a 1.22±0.09a 1.20±0.13a 1.19±0.06a 1.24±0.04a 1.21±0.11 0.386 0.817 24 h 1.31±0.07a 7.02±0.14b 4.24±0.19c 3.63±0.14d 2.76±0.22e 3.79±1.92 1 398.9＜0.001 96 h 1.22±0.11a 3.85±1.74b 2.20±0.16c 1.80±0.05d 1.34±0.12a 2.08±0.97 535.4＜0.001 F 值1.986 4408.6 717.8 1547.3 336.4 4163.2*547.2#P 值0.174＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001*＜0.001#

2.1.4 各组大鼠生命体征结果及脱落情况Sham组大鼠生命体征平稳，未有受试脱落情况；IR 组、IR+DEX 组、IR+ADSCs 组均有2 例大鼠因生命体征恶化死亡，而IR+DEX+ADSCs 组1 例大鼠出现呼吸抑制导致实验后观察期死亡。

2.2 HE 染色结果各组大鼠实验处理96 h 后HE染色结果，Sham 组：无明显异常（图1A）；IR 组：可见显著的肾小管结构破坏紊乱、管腔扩张、管型形成、同时伴有肾间质出血等（图1B），而IR+DEX 组、IR+ADSCs 组上述病理情况较IR 组有一定改善，肾间质出血、水肿减少，仅见较少量管型及肾小管肿胀（图1C、D），而IR+DEX+ADSCs 组较IR+DEX 组、IR+ADSCs 组的肾组织损伤改善更为显著，肾小球及肾小管结构相对完整，肾间质出血、水肿基本消失（图1E）。

图1 各组96 h 后HE 染色结果及肾组织损伤评分（100 μm，×200）Fig.1 HE staining of each group after 96 h and scores of kidney pathological injuries（100 μm，×200）

2.3 各组肾脏组织病理损伤评分96 h 肾组织损伤病理结果显示，Sham、IR、IR + DEX、IR + ADSCs和IR+DEX+ADSCs 组的96 h 肾组织损伤评分分别为0、（4.25 ± 0.71）、（3.25 ± 0.71）、（3.00 ± 0.53）和（1.88±0.64），各组间损伤评分差异有统计学意义（χ2=32.510，P＜0.001）。

3 讨论

脂肪干细胞由ZUK 等［6］于2001年首次在脂肪组织中分离获得，近年来逐渐成为间充质干细胞的研究热点，在再生医学研究领域如器官损伤修复方面呈现出较好的应用研究前景。

结合既往肾缺血再灌注的建模方法及预实验结果，本研究最终采用夹闭双侧肾动脉40 min 的方案。通过观察造模后肾脏颜色的典型改变（由红变苍白后呈黑紫）及结合显微镜下肾脏病理改变及相关肾功能指标，验证建模成功。参考既往的研究报道［7-8］，探索有关注射ADSCs 的细胞量、时间及途径，本文选择ADSCs 的实验细胞量为1×106，并选择注射时间为肾缺血再灌注后4 h；既往ADSCs 研究中，关于注射途径的有经肾动脉、尾静脉或者局部注射等方法，本研究采用简便易行的尾静脉注射方法，以确保实验的重复性及稳定性。

有关右旋美托咪定对器官缺血再灌注损伤保护作用的研究报道，其给药途径和浓度均有一定差异。有研究采用右旋美托咪定1、10 μg/kg 两种浓度静脉注射的方法，结果表明缺血前预先静脉注射1 μg/kg，比缺血后注射10 μg/kg，具有更佳的肾缺血再灌注损伤的保护作用［9］，也有研究采用持续静脉输注的方法也取得了一定的肾保护作用［10］。既往有关右旋美托咪定腹腔内注射的剂量在10 ～100 μg/kg 之间，缺血前1 h 给药对器官缺血再灌注的保护作用更为显著。结合预实验结果，确定试验给药方案为肾缺血再灌注损伤前30 min、腹腔注射25 μg/kg。

为减少评价者主观偏倚的发生，本研究选择双盲条件下，由病理科医生对各组大鼠肾组织病理损伤情况进行显微镜下评估。本研究结果显示，IR 组肾脏病理损伤最为严重，多数显示肾小管管腔重度扩张，上皮细胞大量凋亡坏死，肾小管内出现颗粒管型、大量红细胞管型等，同时有多数肾间质出血、水肿等。IR+DEX、IR+ADSCs 组肾脏病理损伤均得到显著的缓解；而IR+DEX+ADSCs组则进一步显著改善。因此，右旋美托咪定和ADSCs 联合使用具有更好的肾缺血再灌注组织损伤保护作用。

血肌酐及尿素氮能较客观地反映肾小球滤过率，是肾脏功能评价的常用指标。尿蛋白/肌酐比值相对于单纯的尿蛋白检测，能更加灵敏地反映肾小管损伤程度。本研究采用上述三种指标能更全面评估肾脏损伤的程度。IR+DEX 组的三项指标均比IR 组明显降低，同时在肾病理损伤上也有显著的改善，该结果与既往多项研究中右旋美托咪定减轻肾损伤结果是较为一致的［9-12］。在24 h时，三项指标水平更低，且在处理72 h 下降最为显著，但96 h 后上述指标未进一步显著下降，其趋势与多项报道结果接近。与IR 组比较，IR+ADSCs 组在肾功能和病理组织损伤均有一定程度改善，和既往ADSCs 减轻AKI 的研究结果相符［8，13］，但各实验中ADSCs 的用量、给予途径及评价时间点有所不同，因此在一致的研究方案的对比需进一步探索。本研究中，与处理前比较（0 h），ADSCs 组处理后24 h，血肌酐、尿素氮及尿蛋白/肌酐比值均大幅降低，至96 h 后仍然有小幅度下降；肾脏病理损伤评分结果也有显著改善，该结果与SHEASHAA等［8］报道的结果变化趋势吻合；此外有报道［13-15］观察1 周以上的评价结果，表明ADSCs 同样具有改善肾功能并可减轻肾脏纤维化等作用，表明其具有较长期的肾保护作用。

IR+DEX 组和IR+ADSCs 组在实验处理后24 h的组间比较，两者对肾脏缺血再灌注损伤后的保护作用是大致接近。值得关注的是：与上述两组比较，IR+DEX+ADSCs 组，尽管在24 h 在血肌酐、尿素氮方面无明显差异，但其处理后96 h 的血肌酐、尿素氮、尿蛋白/肌酐比值及肾损伤评分在都显著优于上述两组，其中96 h 的尿蛋白/肌酐比值与同组缺血-再灌注处理前（0 h）的水平无明显差异，说明其对肾小管损伤的修复作用显著。

本研究不足之处在于未能进一步探讨其保护作用的具体机制，根据既往报道可能与两者对肾缺血再灌注后损伤的抑制炎症、抗氧化应激等作用相关［16-21］。

总之，虽然单独使用右旋美托咪定或ADSCs，对改善肾缺血再灌注损伤后的肾功能及肾组织损伤均有一定作用，但联合使用比单独使用其中之一，具有更显著的肾脏保护作用。