miR-132基于PGC-1α/SIRT3信号通路对肺炎链球菌诱慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠的干预作用

张松松 刘曼莉 王金龙 潘渝 施贤清

贵州省人民医院1重症医学科，2重症监护室（贵阳550002）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）属持续气流受限和不完全可逆的肺部疾病，发生率逐年升高，细菌感染是导致此病的主要因素［1-2］。微小RNA（miR）属于一类内源性非编码RNA，随着临床上对其的不断研究发现，多数miR 参与COPD 的进展，如miR-146a、miR-155、miR-145 等，已经证实多数miR 参与COPD 发展过程中炎症反应的调控［3］。基于上述背景在本文研究中首次分析miR-132 是否经PGC-1α/SIRT3信号通路对肺炎链球菌诱慢性阻塞性肺疾病加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）大鼠的干预作用，明确其作用，为临床上此病的研究提供新方向。

1 材料与方法

1.1 材料研究动物：选取60 只SPF 级SD 雄性大鼠，8～12 周龄，购自冠科生物技术（中山）有限公司，动物许可证号：SYXK（粤）2020-0240，体质量160～210 g，均预喂养7 d，光照12 h。获我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 分组及建模选取15只大鼠作为A组，其余构建肺炎链球菌所诱导的AECOPD 模型［4］，置于烟熏箱，放置香烟，3 个月后自气道注入0.2 mL 肺炎链球菌混悬液。成功标准：初期可见有呼吸短促、精神不振、食欲减退、纳呆等表现，继而出现气喘、毛色暗淡、反应迟钝。最终45 只均建模成功。将所制备的模型随机分为B 组（单纯模型）、C 组（模型+沉默）、D 组（模型+过表达）各15 只。

1.2.2 miR-132转染将miR-132模拟物（过表达）、miR-132 抑制物（沉默）利用Lippofectamine 2000 试剂盒稀释为5 mmol/L，分别注射于D组、C组大鼠肺部，A、B组注射生理盐水，注射1 d后观察大鼠变化。

1.2.3 miR-132 转染效率验证取各组中5 只鉴定miR-132 转染效率，麻醉后处死，取肺组织，采用RT-PCR 法检测miR-132 转染效率。

1.2.4 指标检测（1）全自动动物肺功能测试仪测定肺功能，包括0.3 s 用力呼气容积与用力肺活量比值（FEV0.3/FVC）、吸气峰流量（PIF）、呼气峰流量（PEF）。（2）贝克曼血液分析仪测定白细胞、中性粒细胞百分比计数。（3）酶联免疫吸附试验法测定血清IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。（4）Western blot法检测肺组织PGC-1α/SIRT3 信号通路蛋白表达量，将所制备的肺组织做10 000 ×g离心处理10 min，BCA 蛋白定量，DAB 显色，分析PGC-1α、SIRT3 表达。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0 统计软件进行分析处理。计量资料采用均数±标准差描述，多组间采用方差分析，两组间采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-132 表达对比与A 组相比，B、C 组miR-132 降低，D 组miR-132 升高（P＜0.05）。见表1。

表1 miR-132 表达对比Tab.1 miR-132 expression contrast ±s

表1 miR-132 表达对比Tab.1 miR-132 expression contrast ±s

注：与A 组相比，aP＜0.05；与B 组相比，bP＜0.05；与C 组相比，cP＜0.05

组别例数miR-132 A 组B 组C 组D 组5 5 5 5 1.00±0.01 0.63±0.15a 0.19±0.07ab 1.69±0.32abc

2.2 肺功能对比B、C、D组FEV0.3/FVC、PIF、PEF低于A 组（P＜0.05）；C 组FEV0.3/FVC、PIF、PEF 低于B 组，D 组FEV0.3/FVC、PIF、PEF 高于B、C 组（P＜0.05）。见表2。

表2 肺功能对比Tab.2 Pulmonary function comparison ±s

表2 肺功能对比Tab.2 Pulmonary function comparison ±s

注：与A 组相比，aP＜0.05；与B 组相比，bP＜0.05；与C 组相比，cP＜0.05

组别A 组B 组C 组D 组例数10 10 10 10 FEV0.3/FVC（%）84.96±6.79 61.02±3.65a 52.34±2.13ab 77.82±5.16abc PIF 4.98±1.04 2.34±0.24a 1.86±0.12ab 3.89±0.86abc PEF 3.56±0.96 1.86±0.38a 1.04±0.21ab 2.57±0.34abc

2.3 白细胞总数、中性粒细胞百分比计数、气道炎症反应对比B、C、D 组白细胞总数、中性粒细胞百分比计数、IL-1β、IL-6、TNF-α 高于A 组（P＜0.05）；C 组白细胞总数、中性粒细胞百分比计数、IL-1β、IL-6、TNF-α 高于B 组，D 组白细胞总数、中性粒细胞百分比计数、IL-1β、IL-6、TNF-α 低于B、C 组（P＜0.05）。见表3。

表3 白细胞总数、中性粒细胞百分比计数、气道炎症反应对比Tab.3 Comparison of total leukocyte counts，neutrophils，airway inflammatory responses ±s

表3 白细胞总数、中性粒细胞百分比计数、气道炎症反应对比Tab.3 Comparison of total leukocyte counts，neutrophils，airway inflammatory responses ±s

注：与A 组相比，aP＜0.05；与B 组相比，bP＜0.05；与C 组相比，cP＜0.05

组别A 组B 组C 组D 组例数10 10 10 10白细胞总数（×109）1.82±0.49 10.25±2.19a 14.52±2.63ab 5.13±1.01abc中性粒细胞百分比（%）23.36±2.46 67.52±6.49a 76.68±7.26ab 35.15±3.19abc IL-1β 2.00±0.38 6.24±1.02a 8.49±2.24ab 3.59±0.54abc IL-6 2.32±0.55 5.42±0.32a 6.98±1.05ab 3.02±0.21abc TNF-α 1.52±0.24 7.68±1.04a 9.52±2.69ab 2.89±0.52abc

2.4 PGC-1α/SIRT3 蛋白表达对比B、C、D 组PGC-1α、SIRT3 表达低于A 组（P＜0.05）；C 组PGC-1α、SIRT3 表达低于B 组，D 组PGC-1α、SIRT3 表达高于B、C 组（P＜0.05）。见表4。

表4 PGC-1α/SIRT3 蛋白表达对比Tab.4 PGC-1α/SIRT3 protein expression contrast x±s

3 讨论

COPD 的发生多因接触有害气体、细菌感染所致，急性期更为严重，患者病死率较高，目前对于此病的治疗手段虽较多，但整体疗效不理想，多数患者预后仍不佳［5-6］。因此寻找新的治疗COPD 的靶点对改善患者预后、促进患者疾病恢复具有重要的意义。

miR 属于一类非编码的内源性微小RNA，其可经介导mRNA 降解、抑制转录发挥调控多种基因表达的作用，多种miR 参与机体局部炎症反应［7-8］。miR-132 属于miR 家族成员之一，其具有进化保守性，参与机体多种生理病理过程［9-11］。临床多项研究显示［12-13］，miR-132 参与COPD 肺损伤的修复。基于上述研究基础，在本文研究中为了进一步验证miR-132 是否可作为COPD 治疗的新靶点，结果显示，经miR-132 过表达处理的大鼠气道炎症反应被抑制，肺功能改善，而miR-132沉默处理的大鼠上述表现更为严重。此结果提示，miR-132 可能参与COPD 的进展。

COPD 发生后肺泡上皮细胞出现大量凋亡现象，而肺泡上皮细胞的凋亡可进一步破坏肺泡-上皮屏障，最终形成肺水肿［14-15］。PGC-1α/SIRT3通路与细胞凋亡相关，PGC-1α 属于转录调节因子成员之一，具调控机体氧化应激反应、线粒体代谢、局部炎症反应作用［16-18］。SIRT3 属PGC-1α 的下游靶基因，其在线粒体基质中所表达，PGC-1α 被激活后可经诱导SIRT3 表达增加SIRT3 活性，最终参与细胞凋亡、线粒体氧化代谢等过程［19-22］。谢圆媛等［23］研究认为PGC-1α/SIRT3 通路与COPD 相关，经激活此信号通路可抑制气道炎症发挥作用。本研究结果发现，经miR-132 过表达处理的大鼠肺组织PGC-1α/SIRT3信号通路蛋白表达明显升高，因此本文进一步推测miR-132 可能经激活PGC-1α/SIRT3信号通路可抑制气道炎症，修复损伤的肺功能。

综上所述，经转染miR-132 模拟物可抑制肺炎链球菌诱AECOPD 气道炎症，修复肺损伤，机制可能与激活PGC-1α/SIRT3 信号通路PGC-1α 上调SIRT3 相关。