不同浓度生长因子对人脐静脉内皮细胞增殖影响的实验研究

魏建国 段东明 井一涵 娄爱菊 曾裕威 刘子恺 王簕

广州医科大学附属第三医院1骨科，2再生医学与3D 打印转化中心（广州510150）；3广州医科大学附属荔湾医院风湿科（广州510150）

组织修复是一个复杂的过程，基本包括炎症反应期，肉芽生成期，以及组织塑形期。细胞作为器官组织的基本构成单位，需要细胞大量增殖、分化来形成组织［1］。而组织修复需要生长因子在时间空间上相互调节细胞增殖、分化、成血管以及组织生长的基因表达［2］。血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）是血小板α 颗粒中的一种碱性蛋白质，当PDGF 和靶细胞的受体结合后，细胞合成新的DNA，从而促进细胞有丝分裂而增殖［3］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，能促进血管内皮细胞的增殖分化，在血管系统发生发展过程中起着明显的调节作用［4-5］。随着医学发展，PDGF 和VEGF 将被越来越多的应用于再生修复治疗，如治疗老年性骨量丢失、糖尿病创面等［6-8］。近来，生物材料在医学再生领域研究以及应用较为火热，如水凝胶、3D 打印支架等［9-11］。这些材料基本由明胶（gelatin）或者PCL 等为基材，通过化学或物理方式对其进行改造成为生物修复材料，并负载药物如生长因子，给组织提供修复微环境以促成骨或促成血管［12-13］。

虽然生长因子对组织修复的作用很重要，但目前学术界对于如何把控生长因子的剂量使用研究鲜有报道［14-16］，推测存在一个生长因子浓度，对组织修复有最佳的效应。本研究将使用不同浓度的PDGF-BB 和VEGF-A，在二维和三维培养条件下，探讨其对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）增殖效率的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料PDGF-BB（近岸蛋白）、VEGF-A（MCE）、明胶（typeA，sigma）、透明质酸（40 kDa，华熙福瑞达）、lenti-eGFP（CyagenBiosciences）、HUVEC（CyagenBiosciences），tryple（Gibco）、CCK-8（碧云天）、Carbohydrazide（HDZ，Aladdin）、1-Hydroxybenzotriazolemonohydrate（HOBt，Aladdin）、1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimidehydrochloride（EDC，Aladdin）、（S）-3-Amino-1，2-propanedlol（Aladdin）、NaIO4（Macklin），EG（Ethylene Glycol，Macklin），ECM（EndothelialCellMedium，ScienCell），FBS（Gibco），双抗（Solarbio），荧光显微镜（OlympusIX83），酶标仪（TECANM200pro）。

1.2 实验分组在完全培养基中加入不同浓度的PDGF-BB 或者VEGF-A，按因子浓度将实验分成以下组：0 μg/mL 组（Control组）、0.02 μg/mL GFs组、0.2 μg/mL GFs 组、2 μg/mL GFs 组、5 μg/mL GFs组，每组至少设置3 个复孔。

1.3 水凝胶材料的制备作为三维培养的生物材料，用经碳酰肼改性的gelatin 和醛基修饰的HA，碳酰肼基团和醛基之间交联形成稳定的希夫碱［17］，凝胶整体较为稳定。对于Gel-CDH 的合成，准备300 mL 的1%明胶水溶液，剧烈搅拌下加入6.49 g HDZ，1.1 g HOBt，调节溶液pH 4.7，反应1 h 后加入0.46 g EDC，反应过夜。第二天经0.3 mol/L NaCl，纯水透析4 d，最后冻干得Gel-CDH。对于HA-mCHO的合成，其分两步反应；首先，准备500 mL 的2%HA 水溶液，剧烈搅拌下加入4.55 g Amino，3.83 g HOBt，调节pH 6.0，反应2 h后加入1.45 g EDC，反应过夜。第二天经0.3 mol/L NaCl，纯水透析4 d，最后冻干得HA-mCHO-diol。准备482 mL 的1%HAmCHO-diol 水溶液，剧烈搅拌下，加入2.58 g NaIO4水溶液，避光反应5 min，随后加入14.95 g EG，反应2 h。0.3 mol/L NaCl，纯水透析4 d，最后冻干得HA-mCHO。

1.4 HUVEC 的培养与lenti-eGFP 的转染及观察鉴定原代HUVEC 购买于Cyagen Biosciences，使用ECM 完全培养基接种于T75 培养瓶，于37 ℃、5%CO2无菌培养箱培养。在细胞状态良好的早期代数中消化并收集细胞，重悬细胞至5 × 105/mL，再接种于24 孔板内，每孔1 mL 细胞悬液，于细胞培养箱培养。次日，将慢病毒、Polybrene 取出，于冰浴融解并保持低温状态；取20 μL/孔对应的lenti-eGFP 总量加入到对应培养基中，轻柔混匀；再加入5 μg/mL 对应的Polybrene 轻柔摇匀，吸去原有培养基，PBS 冲洗1 次；加入含lenti-eGFP 培养基；轻轻摇动培养皿，使培养基覆盖所有细胞；放入细胞培养箱中。24 h 后，吸去原有lenti-eGFP 培养基，更换为新鲜的完全培养基，得到lenti-GFP HUVEC。24 h 及72 h 观察荧光转染效果。

1.5 二维条件下给予不同浓度生长因子的GFPHUVEC培养效果观察实验对象取自上述实验经GFP 转染的HUVEC。GFP-HUVEC 按照1 × 105/mL接种于24孔板内，培养1 d以稳定细胞状态。随后，在状态良好情况下，除去孔内培养基，PBS 洗涤1 次，加入新鲜的含不同浓度PDGF-BB或者VEGF-A的1 mL 完全培养基，每天更换1 次新鲜培养基。按照预定分组，每组设置3 个复孔。在第1、4、7 天时，在荧光显微镜下观察并拍照，并使用image-Jv1.58 软件对荧光数量进行半定量分析。

1.6 二维条件下CCK-8HUVEC 增殖检测实验对象取自上述实验第4 代HUVEC，使用tryple 收集足够数量并且状态良好的HUVEC，以5 × 103/mL数量接种至24 孔板内，培养1 d 以稳定细胞状态。而后在细胞状态良好情况下，除去孔内培养基，PBS 洗涤1 次，加入新鲜的含不同浓度PDGF-BB 或者VEGF-A 的100 μL 完全培养基，每天按此换液1 次。按照预定分组，每组设置5 个复孔。在第1、4、7 天时，按照CCK-8 说明书检测OD值。

1.7 三维条件下给予不同浓度生长因子的GFPHUVEC 培养效果观察实验对象取自上述实验经GFP 转染的HUVEC。首先取Gel-CDH 制备4%的PBS 溶液于无菌EP 管中，置于37 ℃中备用。再取HA-mCHO 制备5.34%的PBS 溶液于无菌EP 管中，用0.22 μm 滤膜过滤残渣后备用。收集足够数量并且状态良好的GFP-HUVEC，用PBS 重悬至2 × 106/mL，然后以此细胞悬液稀释等量的HAmCHO 溶液至2.67%。最后，25 μL Gel-CDH 和含细胞的25 μL HA-mCHO 剧烈混合，并静置30 min以充分反应。凝胶放入24 孔板，每孔含1 mL 不同浓度PDGF-BB 或者VEGF-A 的完全培养基。每孔设置3 个复孔。在第1、4、7 天时，在荧光显微镜下观察并拍照，并使用imageJv1.58 软件对荧光数量进行半定量分析。

1.8 统计学方法实验结果数据用（）表示，由统计软件SPSS 20.0 进行统计分析，graphpadprismv 8.0 进行数据绘图展示。实验各组样本结果均数采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HUVEC 培养和慢病毒转染效果HUVEC 按照供应商的实验方法并结合本实验研究计划进行培养并转染lenti-eGFP，细胞状态良好，可以用于后续的实验（图1）。

图1 HUVEC 培养和慢病毒转染后1 d 和3 d 的效果Fig.1 Effects of HUVEC culture and lentivirus transfection on day 1 and day 3

2.2 二维条件下给予不同浓度生长因子的GFPHUVEC 培养效果为了观察镜下HUVEC 的生长情况，按照预定实验计划，除了使用完全培养基外，对实验对象额外单独添加两种不同浓度的PDGFBB 和VEGF-A，以不加生长因子作为实验对照组。在PDGF-BB 实验组内（图2a-b），在第1、4、7 天，2 μg/mL 组始终保持较高的荧光数量（P＜0.01）；同样，在VEGF-A 组实验组内（图2c-d），0.2 μg/mL组表现出相同趋势（P＜0.05）。此外还观察到，5 μg/mL 组呈现低荧光数量。可见，2 μg/mL 的PDGFBB或者0.02 μg/mL 的VEGF-A 对HUVEC起明显促进效果（P＜0.05）。

图2 不同浓度PDGF-BB 或VEGF-A 下HUVEC 在孔板中的生长情况Fig.2 Proliferation of HUVEC in plate with different concentrations of PDGF-BB or VEGF-A

2.3 二维条件下CCK-8 检测HUVEC 增殖结果为了检测在二维条件下HUVEC 的增殖情况，在给予了不同浓度PDGF-BB 或者VEGF-A 后进行了CCK-8 检测，见图3。在第1 天时，PDGF-BB 实验组内，与对照组相比，2 μg/mL 与5 μg/mL 细胞增殖情况有所下降（P＜0.05），而其余组却无明显差别（P＞0.05）；但在第4、7 天时，2 μg/mL 组保持较高增殖活性（P＜0.05）。在VEGF-A 组内，第1、4、7天时，0.02 μg/mL 组始终保持较高的增殖活性（P＜0.05）。但观察到两个因子5 μg/mL 组表现较低甚至是抑制效应。说明这与上述的结果相一致，并且过高的因子浓度可能会出现抑制效应。

图3 CCK-8 检测不同浓度生长因子对HUVEC 增殖的影响Fig.3 Effects of different concentrations of growth factors detected by CCK-8 on HUVEC proliferation

2.4 三维条件下给予不同浓度生长因子的GFPHUVEC 培养结果按照预定实验计划，将转染了慢病毒的HUVEC 包裹进水凝胶里面，以模拟三维生长环境，并在培养基中添加不同浓度生长因子，观察其生长情况。在第1、4、7 天，PDGF-BB 组内2 μg/mL 始终表现出较多荧光数量（P＜0.01）。VEGF-A 组内0.02 μg/mL 与前者表现出相同趋势（P＜0.01）。说明在三维条件下，仍以2 μg/mL 的PDGF-BB 或0.02 μg/mL 的VEGF-A 对HUVEC 有更好的促进效应，过高的因子浓度可能会出现抑制，这与上面的实验结果较为相符。

3 讨论

生长因子是一类调节细胞组织正常生长代谢所必需的有机物，其可控制组织缺损修复、创面愈合等过程中的许多关键细胞活动，如新血管生成、细胞迁移与增殖等［18-19］。由于生长因子良好的修复作用，所以为各种原因导致的创伤治疗带来了新的希望。水凝胶是生物相容性较高的再生修复材料，负载生长因子之后，它可以随时间而逐渐降解并释放更多的生长因子，因而进一步促修复，形成良性循环，最终材料降解消失，组织愈合［20-21］。LIENEMANN 等［22］和贾乐宁等［23］用含生长因子的水凝胶研究修复效应，得出其能明显促进骨缺损修复和新血管生成的结论。

虽然生长因子已被广泛使用，但许多研究对其剂量的效应探讨并无详细赘述，如果在治疗修复方面每次都使用大剂量，那可能将会对患者产生过高的消费，副作用及其他未知问题［24］。在此，笔者探讨了较低浓度下的PDGF-BB 和VEGF-A 对于再生修复的效果。以GFP-HUVEC 为实验对象，将其接种在孔板上或者在水凝胶里面，再添加不同浓度的PDGF-BB 和VEGF-A 进行培养，用lenti-GFP的荧光和CCK-8 来检测，结果发现，2 μg/mL 的PDGF-BB 或0.02 μg/mL 的VEGF-A 始终对细胞表现出促进作用。

虽然已基本证实有一个浓度的生长因子对细胞表现出最佳促效应，但是在凝胶实验中还发现细胞在其中生长速率总体比在孔板中较慢。水凝胶是含大量水、少量gelatine 和HA 组成的生物材料，形成有一定密闭性的微环境，而HUVEC 生长会涉及延伸、黏附以及成网等。猜测这可能水凝胶对培养基中的物质通透、对细胞的生长限制等有关。如能对凝胶的理化性质如物质通透性等进行测试，可能将更了解该凝胶对细胞的生物兼容性。

综上所述，得出结论，2 μg/mL PDGF-BB 和0.02 μg/mL VEGF-A 对HUVEC 产生的增殖效果最好，过高浓度的生长因子对于其可能有抑制作用。但本研究只在细胞层面验证了该结论，由于体内微环境的复杂性，尚不清楚在动物模型上是否得到相同的结论。后续会在本文基础上增加动物模型实验，使结论更具可靠性。

图4 不同浓度PDGF-BB 或VEGF-A 下HUVEC 在凝胶中的生长情况Fig.4 Proliferation of HUVEC in hydrogels with different concentrations of PDGF-BB or VEGF-A