儿童耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药机制综述

刘慧，张妮，徐晓楠，山国栋

(1.兰州大学第二医院 小儿消化科，甘肃 兰州 730000；2.白银市第二人民医院 神经外科，甘肃 白银 730900)

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)于1961年首次被发现，现在已经成为全球范围内主要的致病菌。近年来，我国MRSA感染情况较为严峻：2019年CHINET中国细菌耐药监测的结果显示金黄色葡萄球菌占所有革兰阳性菌株的32.2%，其中MRSA检出率31.4%，且耐药率及多重耐药率较高[1]。在儿童患者中MRSA的感染率及预后不容乐观：2018年我国ISPED监测的儿童感染菌中MRSA占金黄色葡萄球菌株的34.9%，且常用抗生素耐药率高[2]。吴霞等[3]的研究显示感染MRSA的452例患儿中，预后不良及病死率分别为9.5%、2.7%。现因MRSA的高耐药性使得临床上只能选用特定药物(万古霉素、达托霉素和利奈唑胺等)进行替代治疗。因此，寻找及研究新的治疗方法十分重要。金黄色葡萄球菌因其对抗生素的耐药性，具有较高的适应宿主能力。金黄色葡萄球菌的耐药性主要包括固有性耐药和获得性耐药。固有性耐药即自身染色体携带耐药基因，获得性耐药是从其他葡萄球菌菌株甚至其他菌属获得耐药基因，移动遗传元件(mobile genetic elements，MGE)在其中起核心作用。金黄色葡萄球菌通过MGE的转化、转导、结合等多种方式获得染色体外的DNA片段从而适应不同宿主环境及抗生素。金黄色葡萄球菌的MGE包括金葡菌盒式染色体(staphylococcal cassette chromosomemes，SCCs)、质粒、转座子、噬菌体、插入序列、致病岛、整合性接合元件和整合子等，其中除噬菌体不能携带基因外，其他MGE均可携带基因[4]。这些MGE主要通过产生细菌灭活酶和修饰酶、改变抗生素作用靶位、主动外排等方式使金黄色葡萄球菌耐药。本文主要就这3种机制进行分别综述。

1 细菌灭活酶及修饰酶的产生

MRSA几乎100%对甲氧西林、β-内酰胺类抗生素及与β-内酰胺类结构相似的头孢类药物耐药，其耐药机制之一就是β-内酰胺酶的产生。β-内酰胺酶属于诱导酶，可水解破坏含有β-内酰胺环的抗生素，使这类抗生素失活而耐药。金黄色葡萄球菌通过结合或者转导质粒获得β-内酰胺酶的编码基因，参与的调控基因有结构基因、阻遏蛋白和抗阻遏蛋白等。阻遏蛋白对β-内酰胺酶主要起负调节作用，抗阻遏蛋白在感受到β-内酰胺类药物时会产生信号使阻遏蛋白开始转录，从而产生β-内酰胺酶破坏β-内酰胺类抗生素，使其失去作用[5]。Hashizume等[6]研究发现β-内酰胺类抗生素的耐药性可以被其他药物所逆转，如天然脂肽抗生素三肽C在单独或与β-内酰胺类抗生素联合治疗MRSA时，天然脂肽抗生素三肽C可以通过降低结构基因和MecA基因的表达来逆转β-内酰胺类抗生素的耐药性。

氨基糖苷类抗生素的耐药机制也与修饰酶的产生相关。在儿童感染的MRSA菌株中对氨基糖苷类抗生素的耐药率较高，如董方等[7]的研究显示2009—2015年北京儿童医院分离的425例MRSA菌株中庆大霉素的耐药率为24.2%。氨基糖苷类修饰酶(aminoglycoside-modifying enzymes，AME)的产生及作用是主要耐药机制。编码AME的基因多数以转座子、质粒和整合子等MGE介导，易于传播。AME使氨基糖苷类药物的氨基或羟基被修饰，影响抗生素与细菌核糖体的结合，使抗菌中断而耐药。AME主要包括乙酰基转移酶(aminoglycoside acetyltransferases，AAC)、磷酸转移酶(aminoglycoside phosphotrans-ferase，APH)及核苷酸转移酶(aminoglycoside nucletidyltransferase，ANT)[8]。MRSA对庆大霉素、妥布霉素和卡那霉素的耐药性均由具有AAC和APH活性的双功能酶AAC(6’)/APH(2’’)介导，此修饰酶为最常见的AME，由aac(6’)/aph(2’’)基因在复合转座子Tn4001上编码而成[9]。ant(4’)-Ⅰa基因编码的ANT(4’)-I酶可介导新霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素和卡那霉素等对MRSA产生耐药性，该基因通常携带在小质粒上，然后整合到较大的结合质粒(如pSK41)中，最后再整合到某些金黄色葡萄球菌分离株的盒式染色体上的(staphylococcal cassette chromosome mec，SCC mec)。另外APH(3’)-Ⅲ酶活性在MRSA对新霉素和卡那霉素的耐药性中也有相关描述，负责此表型的APH(3’)-Ⅲa基因在转座子Tn5405上携带，此转座子可能位于染色体和质粒上。链霉素抗性的遗传学较为复杂，考虑与ant(6)-Ⅰa基因、染色体突变(strA)、aph(3’)-Ⅲ基因和ant(4’)-Ⅰa基因等基因相关[10]。现氨基糖苷类抗生素耐药性高，针对其耐药机制，可以通过研发氨基糖苷类修饰酶的抑制剂来影响MRSA对氨基糖苷类药物的耐药性，如反义寡核苷酸类似物等[11]。

2 抗生素作用靶位的改变

MRSA对β-内酰胺类抗生素耐药的另一种耐药机制即获得与β内酰胺类抗生素亲和力低的青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a，PBP2a)。PBP2a是一种独特的单功能DD-转肽酶，与金黄色葡萄球菌中含有的青霉素结合蛋白(penicillin binding proteins，PBPs)活性相同，可以催化细菌细胞壁的生物合成，而PBPs却为β-内酰胺类抗生素对细菌的致死靶标。β-内酰胺类抗生素使细菌PBPs活性位点丝氨酸发生不可逆酰化作用，使其功能丧失。相反，MRSA获得的PBP2a可成功催化完成细胞壁所必需的DD转肽反应，却不能被β-内酰胺类抗生素酰化，从而耐药[12]。PBP2a由mecA基因编码产生。mecA基因由MGE的SCCs携带，SCCmec是插入在金黄色葡萄球菌orfX基因上的相对较大的MGE，21～67 kb，是MRSA耐药的基因结构基础。目前，从MRSA分离株中已发现13种SCCmec，人源MRSA菌株中主要携带SCCmec Ⅰ～Ⅷ型，其中Ⅰ～Ⅴ型较为常见，占分离株的90%以上[13-14]。我国儿童MRSA菌株以SCCmec Ⅳ型为主，其次为Ⅴ和Ⅲ型[15]。SCCmec主要由mec基因复合体、ccr基因重组复合体以及J区的一些耐药基因组成。mec基因复合体主要由编码PBP2a的结构基因mecA和诱导基因mecR1、抑制基因mecI组成[16]。针对儿童的多项研究显示mecA基因是MRSA耐药性表达的结构基础[17-18]。Ccr复合体位于SCCmec基因的近中部，该复合体主要负责编码耐药基因的位点和特定的切除，将外缘的耐药基因重组到SCCmec基因盒上，也可以识别相对应的SCCmec元件，通过切离、转移、整合等方式达到耐药性在不同葡萄球菌间的转移，使MRSA拥有多重耐药性，最终将SCCmec基因盒重组到orfX上[19]。SCCmec基因盒的3个J区通常还携带抗生素耐药决定簇，可赋予SCCmec元件表达更多的耐药表型。祝强强等[20]的研究显示，研究出抗mecA基因的硫代寡聚脱氧核苷酸，可有效抑制mecA的表达。Otero等[21]的研究显示，头孢洛林可以触发PBP2a活性位点的构象变化，获得头孢洛林的结合位点，增加与PBP2a的亲和力，并使PBP2a快速失活，从而使MRSA失去耐药性。这为基于β-内酰胺抗生素结构的设计开辟新的方向，为以后研究更多针对MRSA的抗生素提供方向。

糖肽类抗生素的作用机制是与细胞壁黏肽合成中的D-丙氨酰-D-丙氨酸残基形成复合物，抑制细胞壁的合成。治疗儿童MRSA主要的糖肽类抗生素有万古霉素和替考拉宁[22]。万古霉素因其良好的治疗效果被广泛应用于临床，因为临床的使用率的增加导致出现了对万古霉素敏感性降低的MRSA菌株(VISA株)及耐万古霉素的MRSA菌株(VRSA株)，国外已有了关于VISA菌株及VRSA菌株的研究[23]，我国有VISA菌株的相关研究，但尚无VRSA菌株相关报道[24]。万古霉素的耐药机制主要是：位于质粒Tn1546内的van操纵子编码合成低亲和力的肽聚糖前体D-丙氨酸-D-乳酸，改变了菌株的肽聚糖链末端成分，使万古霉素结合的靶位消失，从而耐药[25]。研究发现VISA菌株的脂质Ⅱ带有终止于D-丙氨酸-D-乳酸残基的细胞壁肽聚糖结构单元，可能将过量的D-丙氨酸-D-乳酸终止细胞壁链引入VISA分离物的成熟细胞壁中，这些终止细胞壁链可能会作为抗生素的错误靶点捕获部分万古霉素，使万古霉素与真正靶位的结合减少，降低万古霉素敏感性。在VISA菌株中可能还存在一些控制细菌细胞壁生物合成的决定簇的基因突变和/或核糖体基因突变，如walkR、vraSR和rpoB基因等，以及细胞包膜应答基因vraSR和mprF的表达上调，可改变细菌的细胞包膜以适应万古霉素的抗菌作用，使万古霉素的敏感性降低[26]。金黄色葡萄球菌还具有一些遗传调节因子也与万古霉素的敏感性相关，如agr基因等[27]。虽然儿童中少有万古霉素治疗失败的病例，但是对于VISA或者VRSA临床中可选择替代药物或者根据药敏结果选择用药，替代药物有达托霉素、利奈唑胺、头孢洛林等[28]，也可选择联合用药，如β-内酰胺类药。Dilworth等[29]的研究显示β-内酰胺类药物和万古霉素对MRSA有协同作用。

利奈唑胺现已成为治疗MRSA感染的主要药物之一，2011年美国发布的儿童MRSA感染治疗指南[30]中，利奈唑胺作为A级证据用于儿童MRSA感染的治疗，其耐药机制产生的主要有：细菌核糖体23S rRNA的点突变、核糖体L3或L4蛋白的氨基酸突变及甲基转移酶基因cfr介导的核糖体被甲基化等[31]。MRSA核糖体23SrRNA的点位突变改变了利奈唑胺的靶位，而且核糖体23SrRNA的点位突变是自发形成的基因突变，是长期使用利奈唑胺产生的结果，不能在细菌间转移，其中G2576T突变是最常见的突变位点[32]。2015年Cafini等[33]报道了国内携带cfr基因的MRSA对利奈唑胺耐药，而cfr基因主要是编码产生RNA甲基化酶，导致大部分核糖体在23S rRNA的A2503处被甲基化，使MRSA对以核糖体为靶位的利奈唑胺产生耐药，质粒pSCFS7作为该基因的载体可以有效地在不同MRSA中转移。根据利奈唑胺的耐药机制，建议严格利奈唑胺的使用指征及利奈唑胺使用时间，减少耐药性产生。

大环内酯类抗生素对MRSA的耐药机制之一也是靶位的改变。目前针对大环内酯类抗生素的临床耐药率相对较高，尤其是红霉素。2011年美国发布的儿童MRSA感染诊治指南中多次提到在克林霉素耐药率低的地区可经验性给予克林霉素治疗，可见克林霉素对于MRSA的治疗价值[30]。大环内酯类抗生素的主要耐药基因是erm基因，主要有emrA、emrB、emrC以及emrF4种，其中rmA和ermC最常见[34]。erm基因编码甲基转移酶使23S rRNA的特定腺嘌呤残基甲基化，使大环内酯类抗生素的作用靶位减少而耐药，该基因主要由质粒pMS97携带，此质粒上还表达其他两种大环内酯抗性基因msr(A)和mph(C)，其中mph(C)基因考虑与大环内酯类抗生素失活相关[35-36]。

喹诺酮类抗生素作为MRSA的替代药物治疗，主要是通过抑制细菌拓扑异构酶即DNA促旋酶(细菌拓扑异构酶Ⅱ)和拓扑异构酶Ⅳ发挥其抗菌作用。喹诺酮类抗生素与DNA回旋酶或拓扑异构酶Ⅳ之间结合形成复合物之后，喹诺酮类药物诱导酶的构象变化，使DNA被破坏，而且喹诺酮可以阻止断裂的DNA链的重新连接，从而发挥抗菌作用。喹诺酮类抗生素的耐药机制之一是拓扑异构酶的基因发生突变，使喹诺酮类药物不能与细菌的拓扑异构酶结合。金黄色葡萄球菌主要是在拓扑异构酶Ⅱ的gyrA和gyrB基因的突变，使氟喹诺酮类药物对该酶的抑制作用降低[37]。因喹诺酮类抗生素化学结构可修饰的位点较多，近年来，研究者筛选出众多喹诺酮衍生物，可在体内外抗MRSA活性，如2-喹诺酮类化合物、4-喹诺酮衍生物、4-喹诺酮杂合体等[38]，为抗MRSA药物的研究提供新的方向。

四环素是用于治疗和预防细菌感染的广谱抗生素，可用于治疗金黄色葡萄球菌引起的感染，例如皮肤和软组织感染。这类抗生素通过防止氨酰基-tRNA分子与30S核糖体亚基结合而抑制细菌的蛋白质合成发挥抗菌作用。四环素耐药机制之一就是编码核糖体保护蛋白，由位于转座子或染色体上的tetM、tetO、tetQ和tetW等基因合成核糖体保护蛋白将四环素从30S亚基上释放，使四环素与靶位分离，不能抑制细菌蛋白质合成而耐药[39]，此机制是四环素类抗生素主要的耐药机制。

3 外排泵作用

MRSA的耐药机制还可能与膜的外排蛋白的活性即外排泵有关。金黄色葡萄球菌中鉴定出的外排泵主要分为6类：主要促进者超家族、小型多药耐药性家族、多药和毒素挤出家族、ATP结合盒超家族、药物代谢物转运蛋白超家族和抵抗结节科超家族。其中主要促进者超家族、小型多药耐药性家族和多药和毒素挤出家族转运药物的能量由ATP水解提供，ATP结合盒超家族主要利用离子浓度梯度(H+或Na+)或者化学浓度将药物转运通过细胞膜。在金黄色葡萄球菌中鉴定了7个编码的染色体外排系统(NorA、NorB、NorC、MdeA、SepA、MepA和SdrM)和2种质粒编码系统QacA/B和Smr。NorA、NorB、NorC、MdeA和SdrM蛋白是促进者超家族的成员，而MepA是多药和有毒挤出家族的一部分。QacA/B和Smr分别属于促进者超家族和小型多药耐药性家族[40]。Hashem等[41]的研究显示，在中国，人源金黄色葡萄球菌中QacA/B和Smr质粒编码系统发生率分别为85%和79.2%；在染色体外排系统中，NorA、NorB、NorC和MepA的发生率分别为46%、15%、10.2%和6.3%，而且这类基因存在于全球大多数耐环丙沙星的金黄色葡萄球菌中。

大环内酯类抗生素的主动外排耐药机制：由Msr(A)基因介导的大环内酯类特异性外排机制产生，该基因属于ATP结合盒转运蛋白家族，利用离子浓度梯度(H+或Na+)或者电化学浓度将药物转运通过细胞膜，使细胞内的抗生素浓度明显降低从而耐药[40]。

喹诺酮类抗生素的外排泵耐药机制主要与NorA、NorB、NorC和MepA等基因相关[36]。其中NorA基因的过度表达，使NorA蛋白过度产生，NorA蛋白泵吸各种有毒化合物，包括从细菌细胞到外部介质的氟喹诺酮类药物，因此降低了细胞质内的药物浓度而产生耐药[42]。研究发现膜质子泵抑制剂(如奥美拉唑)和竞争性抑制剂(如利血平)可抑制NorA泵的活性，将抗生素与中和耐药性的抑制剂共同使用，可降低抗生素的耐药性。Fontaine等[43]研究提到6-取代吡啶-3-硼酸衍生物可作为NorA外排泵的潜在抑制剂。

四环素获取位于质粒上的tetK和tetL基因通过膜蛋白介导，将药物泵出膜外，使药物浓度降低，即主动外排机制耐药。研究表明带有tetK基因的金黄色葡萄球菌对四环素具有抗性，对米诺环素则无抗性，而tetM基因则对两者都具有抗性[44]。而且tetM/tetK基因组合在耐四环素的MRSA分离物中的发生率比耐四环素的MSSA分离株大约高10倍，同时携带tetK和tetM基因的分离株比仅包含1种基因的分离株显示更高的MIC值。与MSSA菌株相比，tetM基因在MRSA中对四环素抗生素的耐药性中可能起重要作用[45]。

综上所述，MRSA的耐药机制及涉及耐药基因十分复杂，多重耐药造成用药困难，治疗效果差。万古霉素虽然现在仍作为抗MRSA的有效药物，但也逐渐出现了敏感性下降及耐药，需要进一步研究、开发新的抗生素及新的方法治疗多重耐药的MRSA，改变多重耐药的现状，及时有效地控制MRSA的感染。