MCU在低氧诱导肉鸡心肌细胞线粒体损伤中的作用

庞聪颖，乔 娜，陈汉明，马欣艳，张 辉，潘家强，唐兆新，李 英

(华南农业大学兽医学院，广州 510642)

肉鸡肺动高压综合征(pulmonary hypertension syndrome，PHS)是由低温、缺氧、生长过快、遗传等多种因素单一或者共同作用下诱导的肉鸡非传染性营养代谢病，常见于生长较快的肉仔鸡。现代快速生长的肉禽品种对心力衰竭非常敏感，右心肥大衰竭是PHS肉鸡死亡的重要原因[1]。研究发现，PHS肉鸡心肌细胞内Ca2+增加，心肌细胞发生水肿和肥大，颗粒变性、空泡变性甚至坏死[2-4]。心肌细胞Ca2+浓度增加导致细胞钙稳态被破坏，线粒体作为细胞内钙缓冲器，能吸收细胞内增加的Ca2+，调节细胞钙稳态[5]。线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter，MCU)是位于线粒体内膜上的跨膜蛋白，介导细胞内Ca2+进入线粒体基质。MCU过表达可使线粒体内Ca2+浓度增加；MCU沉默使线粒体Ca2+浓度的增加被抑制[6]。其活性受到线粒体钙摄取蛋白1(mitochondrial calcium uniporter 1，MICU1)的调节。MICU1作为MCU的门控蛋白，当细胞质中Ca2 +浓度较低时，MICU1保持MCU处于关闭状态，可减少胞浆中的Ca2+进入线粒体[7]。当细胞质中Ca2+浓度较高时，MICU1作为MCU通道的协同激活剂，通过增加MCU的打开概率，增加激动剂诱发的线粒体Ca2 +浓度增加。线粒体钙单一转运体调节剂1(mitochondrial cal-cium uniporter regulator 1，MCUR1)作为MCU的正调控因子，当其沉默时能抑制激动剂诱导的线粒体Ca2+摄取，并导致线粒体基质中Ca2+浓度显著减少[8]。

心脏的收缩受心肌细胞内Ca2+储存和释放过程调节[6]，细胞内80%的Ca2+储存于线粒体和内质网中。线粒体基质中有大量Ca2+，线粒体产能的过程与线粒体Ca2+转运的过程息息相关。线粒体内Ca2+生理性的增加可激活线粒体脱氢酶，加速氧化代谢，促进ATP生成。但是，线粒体钙超载导致线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的开放，进而导致线粒体去极化，膜电位下降和线粒体碎片化[9-10]。当细胞受损或受到刺激时，常伴有细胞内钙离子浓度的升高[11]。过量游离Ca2+导致的钙超载对细胞具有损伤作用，会引起细胞肿胀破裂，以及通过凋亡、自噬、坏死等路径的细胞死亡[9]。线粒体作为细胞Ca2+超载的重要缓冲器，在细胞Ca2+超载中发挥着重要作用。RU360是一种细胞渗透性氧桥联双核钌胺络合物，作用于MCU，特异性阻断线粒体Ca2+摄取。线粒体通过MCU转运细胞内Ca2+进入线粒体基质，但MCU介导线粒体钙转运是否参与低氧诱导的肉鸡心肌细胞线粒体损伤尚不明确。因此，本试验旨在通过不同时间低氧处理肉鸡心肌细胞，并使用RU360抑制MCU的表达，探究MCU是否参与低氧诱导的肉鸡心肌细胞线粒体损伤。

1 材料与方法

1.1 试验动物

817白羽肉鸡鸡胚购于山东德州忠言肉鸡场，进行常规消毒和处理后，置于旋转孵化箱中37.9 ℃和70%湿度条件下孵化至12胚龄。

1.2 主要试剂和仪器

活性氧试剂盒(S0033)购自南京建成生物工程有限公司；膜电位试剂盒(C2006)、Ripa裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液均购自碧云天生物技术研究所；ECL发光底物试剂盒购自上海天能技术有限公司；F12基础培养液、血清购自Gibco有限公司，Fluo-4，Rhod-2，MCU(#14997)，MICU1(#12524)，MCUR1(#13706)抗体(动物来源：兔)均购自CST公司；TRIzol RNA提取试剂，购自大连宝生物工程有限公司；β-actin 抗体，购自北京锐抗生物技术有限公司；Prime Script Master Mix、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物技术股份有限公司公司。α-横纹肌动蛋白(alpha sarcomeric Actin)单克隆抗体，购自美国Abcam公司；RU360，购自美国Sigma公司。

微量核酸测定仪购自Thermo Fisher科技公司；TDZ5-DZ5型冷冻离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；My Cycler Thermal型 mRNA扩增仪、Light Cycler408型荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；Unique-R10型超纯水仪购自厦门锐思捷科学仪器有限公司；GelView 6000 Pro全自动化学发光成像仪购自广州博鹭腾仪器仪表有限公司；流式细胞仪购自美国贝克曼尔特有限公司。

1.3 鸡原代心肌细胞提取培养与低氧处理

参照张晓辉[12]的方法进行，略作改动。试验中所用器械、耗材等均经过121 ℃、30 min高压灭菌，操作过程中避免细菌污染。将孵化至12日龄的鸡胚无菌操作取出心，浸泡于4 ℃预冷的PBS中。以相同操作取出其余鸡胚的心。将心周围多余脂肪和相连的血管去除，清除心组织内的血液。将心组织剪碎，加入足量预热的0.12%的Ⅱ型胶原酶，37 ℃水浴锅中轻微震荡消化8 min，加入等量含10% FBS培养液，轻轻吹打混匀，收集消化液。多次消化至心组织呈絮状，用200目和400目细胞筛分别滤过消化液。消化液差速离心，重悬后心肌细胞接种于培养板中，37 ℃、5%CO2培养箱中差速贴壁30 min左右(利用成纤维细胞最先贴壁的特性，将心肌组织中的成纤维细胞去除)。收集差异贴壁后的细胞悬液，台盼蓝染色，用细胞计数板对肉鸡心肌细胞悬液计数，调整密度至试验需要。接种于细胞板，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，待心肌细胞生长稳定后更换培养液，继续培养。在细胞处于对数生长期时，分为对照组(C)和试验组(T)，对照组细胞培养条件37 ℃、21%O2；试验组利用培养小室做低氧处理，培养条件为37 ℃、3%O2，处理时间分别为24、48和72 h，做心肌细胞损伤造模。在低氧培养72 h添加RU360预处理组，抑制MCU表达，进一步明确MCU是否参与低氧诱导的肉鸡心肌细胞线粒体损伤。

1.4 心肌细胞鉴定

将细胞爬片置于24孔板孔内，接种肉鸡心肌细胞。生长稳定后，先用PBS洗细胞，4%多聚甲醛固定细胞；0.2% Triton-100细胞打孔；3% H2O2处理15 min；10%马血清，37 ℃，封闭1 h；加入α-SA抗体，4 ℃，过夜；1%BSA配制单抗鼠IgG，室温反应40 min；DAB染色2 min，用PBS终止反应。苏木精复染5 min，盐酸分色3 s，氨水反蓝5 min，干燥，中性树脂封片，镜检。操作同任昊[13]和秦士贞[14]的方法。

1.5 ROS和膜电位测定

收集不同低氧时间处理的细胞，细胞染色和孵育具体操作详见ROS和膜电位检测试剂盒说明书。染色结束后流式细胞仪检测。

1.6 细胞和线粒体内钙离子浓度变化的测定

Fluo-4 AM探针是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，用于检测细胞内的浓度。Fluo-4 AM在细胞外时几乎不发光，当Fluo-4 AM进入细胞后被胞内的酶剪切形成Fluo-4而滞留于细胞内。Fluo-4可以和Ca2+结合，产生较强荧光，其信号强度与Ca2+浓度呈正相关。Rhod-2探针在结合Ca2+前基本不发荧光，荧光信号与Ca2+结合后明显增强。其激发和发射光谱不会随着细胞内游离Ca2+变化发生明显的迁移，其特异性适合检测细胞和组织内线粒体的Ca2+水平，其信号强度与Ca2+浓度呈正相关。将低氧处理24、48和72 h的细胞用预热HBSS清洗3次后，依照试剂说明书进行染色操作，注意染液的配置和染色后细胞的洗涤均使用HBSS缓冲液。

1.7 qRT-PCR分析

qRT-PCR检测MCU、MICU1和MCUR1的mRNA的相对表达水平。按照诺唯赞试剂盒说明书提取总RNA。使用Thermo Fisher科技公司的微量核酸测定仪检测RNA的总浓度和纯度。内参 mRNA为β-actin。使用Primer 3.0软件设计引物序列(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按说明书进行RNA反转录。将反转录得到的cDNA作为模板进行qRT-PCR反应。

表1 qRT-PCR使用的引物序列Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.8 Western blot分析

将不同低氧时间处理的细胞用含苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的RIPA裂解液消化，提取总蛋白。BCA试剂盒测定总蛋白浓度，将每个样品稀释至同一浓度，依照说明书操作，制备蛋白检测样品，-80 ℃保存备用。等量的总蛋白样品在垂直电泳仪上经12.5%SDS-PAGE分离胶分离，再转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉溶液常温摇床封闭1 h，一抗4 ℃摇床孵育过夜。二抗孵育1 h，使用ECL发光液显影，使用GelView6000 Pro全自动化学发光成像系统拍照，Image J软件进行灰度分析。

1.9 数据统计与分析

数据运用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行分组方差分析比较，采用GraphPad Prism 6.0软件进行作图，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 心肌细胞的验证

α-SA能标记心肌肌动蛋白，心肌细胞与α-SA发生抗原抗体反应，表达呈阳性。免疫组化染色后，可见图1A是用PBS代替一抗的阴性对照，细胞胞浆未见棕黄色；图1B的心肌细胞呈明显的阳性着色，胞浆为棕黄色，细胞核接近圆形，心肌细胞呈三角形、梭形和不规则星形。非心肌细胞α-SA抗原表达为阴性，不会出现上述反应，由此可以鉴定为心肌细胞。参照前人的方法[15]，随机选取10个视野进行计数(心肌细胞纯度=心肌细胞数/该视野细胞总数*100%)，心肌细胞纯度约为93%。

A.对照处理;B.阳性结果A.Control treatment;B.Positive result图1 免疫组化染色细胞爬片(400×)Fig.1 Immunohistochemical staining cell slide (400×)

2.2 线粒体功能状态评价

由图2可知，低氧处理24 h，试验组线粒体膜电位上升，差异显著(P<0.05)；低氧处理72 h，试验组与对照组相比ROS的产生增加，线粒体膜电位下降，差异极显著(P<0.01)，说明线粒体发生损伤；低氧处理72 h时，RU360预处理组与试验组相比，在RU360抑制MCU活性后，ROS的产生减少，线粒体膜电位上升，差异极显著(P<0.01)。

A.DCF探针荧光强度分析，反映ROS产生的变化；B.JC-1探针荧光强度分析，反映线粒体膜电位变化A.Fluorescence intensity analysis of DCF probe,reflecting the changes of ROS production;B.Fluorescence intensity analysis of JC-1 probe,reflecting the changes of mitochondrial membrane potential图2 线粒体功能评价Fig.2 Evaluation of mitochondrial function

2.3 细胞和线粒体钙离子浓度变化

由图3可知，低氧处理24和48 h，试验组细胞内游离Ca2+增多，差异显著(P<0.05)；低氧处理72 h，试验组细胞内游离Ca2+增多，差异极显著(P<0.01)，低氧处理72 h时，RU360预处理组与试验组相比，细胞内游离Ca2+减少，差异极显著(P<0.01)。结果表明，低氧诱导心肌细胞内Ca2+浓度增加，抑制MCU的活性能减轻低氧诱导的细胞内Ca2+增多。

a、b、c.分别常氧培养24、48、72 h的心肌细胞内游离Ca2+流式细胞仪分析图;d、e、f.分别为低氧培养24、48、72 h心肌细胞内游离Ca2+流式细胞仪分析图；g.低氧培养72 h且RU360预处理的心肌细胞线粒内游离Ca2+流式细胞仪分析图；h.细胞内Fluo-4探针荧光强度分析a,b and c.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in myocardial cells at 24,48 and 72 h of normal oxygen culture,respectively;d,e,f.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in myocardial cells at 24,48 and 72 h of hypoxia culture,respectively;g.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in the linemere of myocardial cells pretreated with RU360 and incubated for 72 h under hypoxia;h.Fluorescence intensity analysis of intracellular Fluo-4 probe图3 心肌细胞钙离子浓度检测结果Fig.3 Determination results of calcium ion concentration in cardiomyocytes

由图4可知，低氧处理24和72 h，试验组线粒体内游离Ca2+增多，差异显著(P<0.05)，低氧处理72 h时，RU360预处理组与试验组相比，线粒体内游离Ca2+减少，差异极显著(P<0.01)。说明低氧诱导了心肌细胞线粒体内Ca2+浓度增加，抑制MCU活性能减轻低氧诱导的线粒体内Ca2+增多。

a、b、c.分别为常氧培养24、48、72 h的心肌细胞线粒体内游离Ca2+流式细胞仪分析图;d、e、f.分别为低氧培养24、48、72 h心肌细胞线粒体内游离Ca2+流式细胞仪分析图；g.低氧培养72 h且RU360预处理的心肌细胞线粒体内游离Ca2+流式细胞仪分析图；h.线粒体内Rhod-2探针荧光强度分析a,b,c.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in mitochondria of myocardial cells at 24,48 and 72 h of normal oxygen culture,respectively;d,e,f.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in mitochondria of myocardial cells at 24,48 and 72 h of hypoxia culture,respectively;g.Flow cytometric analysis of free Ca2+ in mitochondria of myocardial cells pretreated with RU360 and incubated for 72 h under hypoxia;h.Fluorescence intensity analysis of Rhod-2 probe in mitochondria图4 线粒体钙离子浓度检测结果Fig.4 Calcium ion concentration detection result

2.4 MCU、MICU1、MCUR1 mRNA与蛋白表达水平

由图5可知，低氧处理24 h，试验组MCU、MICU1 mRNA的表达量显著增加(P<0.05)；低氧处理48 h，试验组MCUR1和MICU1 mRNA表达量显著减少(P<0.05)；低氧处理72 h，试验组MCUmRNA的表达量极显著增加(P<0.01)。低氧72 h且RU360预处理组与低氧72 h组相比，MCUmRNA表达量极显著降低(P<0.01)。

图5 低氧处理心肌细胞MCU、MICU1、MCUR1 mRNA表达量Fig.5 mRNA expression levels of MCU,MICU1 and MCUR1 in hypoxic cardiomyocytes

由图6可知，低氧处理24 h，试验组MCU和MICU1蛋白的表达呈上调趋势，差异不显著(P>0.05)，MCUR1蛋白表达呈下调趋势，差异不显著(P>0.05)；低氧处理48 h，试验组MCU和MICU1蛋白表达呈下调趋势，差异不显著(P>0.05)，MCUR1蛋白表达下调，差异显著(P<0.01)；低氧处理72 h，试验组MCU和MICU1蛋白表达呈上调趋势，MCUR1蛋白表达呈下调趋势，都差异不显著(P>0.05)。

图6 低氧处理心肌细胞钙转运蛋白MCU、MICU1、MCUR1相对表达Fig.6 Relative expression of calcium transporter MCU,MICU1 and MCUR1 in hypoxic cardiomyocytes

3 讨 论

肉鸡肺动脉高压常见于生长迅速的肉鸡，因其体型生长过快，导致脏器的生长发育无法满足机体的消耗；机体代谢功能紊乱、Ca2+释放增加、心肌细胞发生肥大及纤维化；心组织变形、肿大、质地变柔软；右心肥大扩张发生衰竭[3,16]。Ca2+刺激线粒体产生能量促进心收缩，也可触发细胞死亡[17-18]。在正常生理状态下，细胞内Ca2+参与不同酶系和各种类型细胞活动调节。细胞外Ca2+的内流和细胞内储存的Ca2+释放是细胞内游离Ca2+浓度增加的主要途径。胞内Ca2+浓度的升高会使受体对Ca2+的敏感性提高，增强钙离子通道的开放，促进胞内Ca2+的释放，进而诱发细胞外的Ca2+内流，而过量Ca2+进入心肌细胞是低血氧时心组织发生病理变化的机制。线粒体作为细胞内Ca2+过载的重要缓冲器，对细胞内钙稳态调节起着重要作用。MCU是位于线粒体内膜上介导胞质Ca2+进入线粒体的重要蛋白，其活性受到MICU1和MCUR1的调控[6,19-20]。本研究通过适度低氧对原代肉鸡心肌细胞进行肺动脉高压的造模，探究MCU在心肌细胞损伤中的作用。细胞内Ca2+来源于细胞外Ca2+的进入和细胞器Ca2+的释放，当细胞内Ca2+达到一定浓度时，细胞内Ca2+反过来抑制细胞器Ca2+的释放，从而保证细胞内Ca2+的数量可以触发生理功能，又不会损伤细胞[21]。本研究发现，低氧诱导肉鸡心肌细胞内Ca2+浓度持续增加，与前人的研究结果一致[22]。细胞内Ca2+浓度的升高会触发细胞的钙缓冲机制，包括促进细胞器对细胞内Ca2+的稀释，而线粒体对Ca2+吸收作用在其中扮演重要角色。本试验发现，低氧处理肉鸡心肌细胞后，线粒体内Ca2+浓度在24和72 h时，显著升高。除此之外，心肌细胞内MCU的转录水平与心肌细胞内线粒体Ca2+浓度变化一致。因此，低氧导致的细胞线粒体Ca2+浓度变化可能与MCU的表达水平变化有关。本研究发现，MCU在低氧处理心肌细胞的过程中，表达先增加后降低再增加的趋势符合线粒体内Ca2+浓度变化趋势，提示MCU介导低氧诱导细胞内增加的Ca2+进入线粒体。线粒体内适当的Ca2+提升，促进线粒体的呼吸功能，但持续的线粒体钙超载，会导致细胞内活性氧生成增加，膜电位降低，引发线粒体发生损伤。有研究显示，氧化应激信号促进MCU氧化并增加其通道活性，在氯化钴化学缺氧开始阶段，MCU介导线粒体Ca2+摄取导致活性氧的产生，活性氧正反馈作用氧化修饰MCU复合物，线粒体持续性Ca2+超载和活性氧积累，过量的活性氧将对细胞组分造成严重损伤，甚至造成细胞死亡[23-25]，并导致相关疾病的发生。随着线粒体钙离子浓度增加，可导致mPTP孔开放，线粒体会因为基质的高渗透压而迅速吸水膨胀导致线粒体外膜破裂，失去对离子流动的选择性引起线粒体膜电位崩溃，ATP生成减少，最终导致细胞死亡[26]。此外，有研究发现，Ca2+通过一系列信号转导活化多种心肌肥厚相关基因，其中MCUmRNA过表达导致肌肉细胞肥大已有证明[27]。本研究发现，在低氧处理早期，MCU介导游离Ca2+进入线粒体，激活线粒体脱氢酶，加快线粒体有氧代谢，膜电位升高；随着低氧处理时间延长，低氧组线粒体膜电位降低，这与Giacomello等[28]的研究发现一致。本研究还发现，与单独低氧处理组相比，RU360与低氧联合处理组中细胞和线粒体内Ca2+浓度下降，ROS下降，线粒体膜电位上升。说明抑制低氧诱导的MCU过表达可以减轻线粒体钙超载，保护线粒体功能。

4 结 论

本研究表明,低氧诱导心肌细胞MCU及其相关基因和蛋白异常表达，导致线粒体钙稳态失衡，线粒体功能下降；抑制MCU表达可以减轻低氧诱导的心肌细胞线粒体钙超载，保护线粒体功能。