四妙丸提取物乙醇提取部位对肝脏脂质蓄积的作用

马晶杰，陈伊梦，姜琪欣，杨 杰，闻晓东

（中国药科大学中药学院，天然药物活性组分与药效国家重点实验室，南京211198）

近年来，随着人们生活水平的提高，肥胖［1］、糖尿病［2］、非酒精性脂肪肝［3］等代谢综合征的发病率逐年上升，已对人类健康构成重大威胁。脂质代谢紊乱与诸症的发生发展密切相关，是各症发生的重要病理因素［4］。肝脏是脂质合成的主要场所，肝脏脂质蓄积可诱导脂肪肝、肝纤维化和肝硬化等后续性肝损伤［4］，也是促进胰岛素抵抗的因素之一［5］。中医虽无脂代谢紊乱的概念，但对“消瘅”、“膏脂”等均有记载，且有“肥人多痰”、“肥人多湿”之说。现代中医学认为，其病因为饮食不节，恣食肥甘，痰浊内生；或肝失疏泄，湿浊内停；或脾虚痰盛证；或脏气衰减，阳虚痰滞，终致痰积血瘀，滞留体内为病。可见，肝脾肾失调，痰湿郁结是代谢综合征的核心病机［6］。因此，健脾助运，清热燥湿是干预脂代谢紊乱的重要治则［7］。

四妙丸由黄柏、苍术、牛膝、薏苡仁组成，具有健脾助运，清热燥湿的功效，临床用于关节炎［8］和痛风［9］等疾病治疗。因此，拓展四妙丸干预代谢综合征的应用具有较好的基础和发展前景。

腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）作为细胞内重要的能量感受器参与脂质代谢的调节，有研究表明小檗碱既可以通过调节AMP/ATP 比值激活AMPK［10］，也可以通过激活LKB1 激活AMPK［11］。四妙丸提取物的60% 乙醇洗脱部位（ESMW）小檗碱的含量达20.47%，因此ESMW 可能调节AMPK改善脂代谢。

本课题组前期研究发现，四妙丸提取物的ESMW是四妙丸调节脂代谢的活性部位，本研究以游离脂肪酸诱导肝细胞脂质堆积细胞模型，探索ESMW改善肝脏脂质蓄积的能力及作用机制，并在高脂饲喂的小鼠中验证ESMW 对肝脏脂代谢的调节作用。

1 材 料

1.1 药品与试剂

ESMW（本课题组制备，提取率0.92%）；脱脂牛血清白蛋白（北京索莱宝科技有限公司）；棕榈酸钠、油酸钠、油红O、BODIPY 荧光染料、Hoechst 荧光染料（美国Sigma 公司）；AMPK 激动剂A-769662（美国MCE公司）；二甲双胍［阿拉丁试剂（上海）有限公司］；高脂饲料D12492、对照饲料D12450B（美国Research Diets公司）；Trizol总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、定量PCR 检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；RAPI 裂解液；BCA 蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；TG、TC、HDL-C、LDL-C、NEFA测试试剂盒（南京建成生物工程研究所）；INS、IL-6、TNF-α ELISA 试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；AMPK、p-AMPK、LKB1、p-LKB1、elF4EBP1、p-4EBP1、FASN 抗体（英国Abcam 公司）；ACC、p-ACC 抗体（美国CST 公司）；SREBP-1 抗体、Reagent、Medium（美国Santa Cruz Biotechnology 公司）；β-actin、羊抗小鼠、羊抗兔抗体（美国Bioworld Technology 公司）；AMPKα、Control siRNA（上海吉满生物科技有限公司）；实验中所用引物均合成于上海生工生物工程有限公司，种属均为小鼠，其序列见表1。

Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.2 仪 器

血糖仪、血糖试纸（三诺生物传感股份有限公司）；酶标仪、自动纯水机、Real-Time qPCR（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；低温高速离心机、梯度PCR 仪（德国Eppendorf 公司）；Olympus IX53 倒置显微镜（日本Olympus 公司）；Nano Zoomer2.0RS切片扫描仪（日本Hamamatsu 公司）；Tanon 5200化学发光成像仪（上海天能科技有限公司）；Nano-100微量分光光度计（杭州奥盛仪器有限公司）。

1.3 细胞株与动物

人肝癌HepG2 细胞株（中科院上海细胞库）；小鼠肝原代细胞由C57BL/6J 雄鼠肝脏灌流提取。SPF 级C57BL/6J 雄鼠，体重18 ～22 g，购于浙江维通利华公司，动物许可证号SCXK（浙）2019-0001。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 药品的制备

苍术和薏苡仁药材饮片按照质量比1∶2混合，10 倍量乙醇加热回流提取2 h，趁热过滤，药渣与牛膝和黄柏药材饮片（1∶2）用30 倍水加热回流提取2 h 后，pH 调至8，12000 r/min 离心10 min 得上清液，用0.22 μm 微滤系统，将制得的上清液过300 kD超滤膜，超滤至截留体积为原溶液的60%；将透过液过10 kD 超滤膜，超滤至截留体积为原溶液的50%。将10 kD 透过部分过AB-8 型大孔树脂，经过吸附和乙醇梯度洗脱，收集60% 乙醇洗脱液，浓缩得ESMW（主要复方中的小分子类化合物，包括：黄柏中9个生物碱类成分phellodendrine，magnofliorine，tembetarine，lotusine，menisperine，columbamine，jatrorrhizine，berberrubine and berberine，苍术中的atractylenolide III 和atractylone，薏苡仁和黄柏中的caffeoyl-CH2-O-quinic acid，牛膝中的dibutyl phthalate）。

2.2 药品的配制

精密称取棕榈酸钠粉末0.02784 g、0.03044 g油酸钠粉末，加入灭菌双蒸水0.5 mL 于75 ℃金属浴上加热至溶液澄清，制得200 mmol/L 的母液。将母液趁热转移至10%BSA 溶液4.5 mL 中得20 mmol/L PA、OA，吹匀，分装，-20 ℃冰箱保存备用。

精密吸取20 mg/mL ESMW 母液50 μL，加入到灭菌PBS 缓冲液2 mL 中，吹匀，即得500 μg/mL 细胞用ESMW 母液，分装并保存于-20 ℃冰箱，按照逐级稀释的配制方法，将500 μg/mL 细胞用ESMW 母液稀释为低中高3 个浓度：ESMW-L（0.5 μg/mL），ESMW-M（1 μg/mL），ESMW-H（2 μg/mL）。

油红O 母液：称取油红O 粉末0.2 g 加入异丙醇40 mL，避光超声使其溶解，置4℃冰箱避光保存备用。

精密称取ESMW，用3% 泊洛沙姆溶液分别配制成7.124 mg/mL 混悬液；二甲双胍用3% 泊洛沙姆溶液分别配制成20 mg/mL 溶液；4 ℃保存，用前混匀。

2.3 脂质蓄积细胞模型的建立与给药

2.3.1 小鼠肝原代脂质蓄积细胞模型的建立与给药 两步灌流法提取小鼠肝原代细胞，DMEM高糖培养基孵育24 h 后，细胞密度为70% ～80%时，加入棕榈酸（palmitate，PA，150 μmol/L）+油酸（oleinic acid，OA，150 μmol/L）（1∶1）或PA+OA+不同剂量的ESMW 或A-769662（2 μmol/L）继续共孵育24 h，收集细胞用于后续实验。

2.3.2 AMPKα 敲减HepG2 细胞脂质蓄积模型的建立与给药 当HepG2 细胞密度达40% ～50%时，将细胞培养基换成无血清无双抗的DMEM 高糖培养基0.8 mL，细胞培养箱孵育40 min，配制转染液。A液：AMPKα siRNA3 μL加培养基97 μL混匀，避光放置备用。（对照组加Control siRNA）；B液：转染试剂3 μL 加培养基97 μL 混匀，避光放置备用。将A 加入B 中，吹匀，避光静置20 min；将混合液0.2 mL 均匀加入一个孔中，轻轻摇匀。12 h后，向转染培养基中加入含血清含双抗的DMEM高糖培养基1 mL，继续培养12 h，再进行验证或者给药。给药：加入棕榈酸（palmitate，PA，150 μmol/L）+油酸（oleinic acid，OA，150 μmol/L）（1∶1），或PA+OA+ESMW（1 μg/mL）共孵育24 h。收集细胞进行Western blot实验或油红O染色实验。

2.4 动物分组造模与给药

将40 只小鼠适应性饲养1 周后，按体重随机分为：对照组（Control）、模型组（Model）、ESMW 给药组（ESMW，71.24 mg/kg，相当于7743.16 mg/kg四妙丸生药量）、阳性药组（二甲双胍，200 mg/kg），每组10 只。对照组小鼠给予对照饲料饲养，其余小鼠均给予高脂饲料饲养。实验开始时，每天灌胃给药，给药体积为0.01 mL/g 小鼠，对照组、模型组给予等体积3%泊洛沙姆溶液。

2.5 实验指标及测定

2.5.1 BODIPY 荧光染色 原代细胞接于共聚焦小皿中，舒展24 h 至密度为60% ～80% 时，造模并给药；给药24 h 后，吸去上清液，用PBS 溶液润洗后，每孔加入BODIPY荧光染料溶液（BODIPY母液稀释1000 倍）100 μL 孵育15 min。弃去BODIPY，每孔加入Hoechst荧光染料溶液（Hoechst母液稀释100 倍）100 μL 孵育10 min。弃去Hoechst，用灭菌PBS 洗3 次后，每孔加入PBS 100 μL，避光在激光共聚焦显微镜63 × 油镜下观察并拍照。

2.5.2 油红O 染色 细胞给药24 h 后，弃上清液，加入37 ℃预热的PBS 溶液1 mL 润洗，吸尽弃去PBS 溶液，每孔加4% 多聚甲醛溶液1 mL，室温固定30 min。吸尽弃去多聚甲醛溶液，每孔加入60% 异丙醇溶液（9 mL 异丙醇∶6 mL PBS）1 mL，室温孵育1 min。吸尽弃去异丙醇溶液，每孔加入油红O 工作液（15 mL 油红O 母液∶10 mL PBS）1 mL，室温避光染色30 min。吸尽弃去油红O工作液，用PBS 溶 液洗4 次，每次5 min。每 孔 加PBS 溶 液1 mL，在倒置显微镜下拍照。

2.5.3 生理状况及体重 记录每周记录两次动物体重，并每天观察记录动物的摄食量、活动及精神状态。

2.5.4 口服葡萄糖耐量 实验第9 周，动物禁食不禁水16 h，酒精棉片擦拭尾尖，消毒剪刀剪尾尖，取1 滴尾尖血于试纸上测量并记录血糖值，为0 min 血糖值。灌胃0.2 g/mL 葡萄糖溶液（2 g/kg，0.1 mL/10 g 动物），分别测定并记录30、60、90、120 min时间点处血糖值，计算曲线下面积。

2.5.5 样品采集和保存 实验第12周，动物禁食不禁水12 h，取血离心得血清，脱颈处死动物，解剖分离肝脏，称重并拍照。肝脏分3份：（1）用胶水包埋做冰冻切片，用于肝脏油红O 染色切片的制作；（2）4% 多聚甲醛固定，用于肝脏HE 染色切片的制作；（3）剩余肝脏样品与血清放置于-80 ℃冰箱冻存。

2.5.6 血清生化指标 按TG、TC、NEFA、TNF-α ELISA 测试试剂盒说明书的方法，对血清样品进行检测。

2.5.7 Western blot 法检测细胞和肝脏的蛋白表达 精密称取肝组织30 mg，加入RAPI 裂解液500 μL，匀浆10 min 后冰上裂解30 min（细胞样品加入RAPI 裂解液30 ～50 μL 后，吹匀冰上裂解30 min）。4 ℃，12000 r/min 离心20 min，避开最上层脂质，取上清液。 BCA 定量后，调至统一浓度，加入5 × 上样缓冲盐，100 ℃金属浴加热变性5 min，将样品插入冰盒降温后，-20 ℃保存备用。每孔加入蛋白样品45 μg，经SDS-PAGE 电泳、半干转膜法转膜后，将PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2 h，对应一抗在4 ℃冰箱中孵育过夜，TBST 洗30 min，对应二抗室温孵育1 h，TBST 洗30 min，ECL显影。每个指标重复3次，Image J计算灰度。

2.5.8 实时荧光定量PCR 实验检测细胞和肝脏的mRNA 表达 精密称取肝组织25 mg，加入Trizol 1 mL，匀浆10 min 后冰上静置5 min（细胞样品加入Trizol 1 mL 吹匀，冰上静置5 min）。提取总RNA 后，Nano-100 定量，按照HiScript II Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）说明书的方法进行cDNA 的合成；按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix试剂盒说明书的方法定量，每个指标重复3次。

2.6 统计学分析

使用GraphPad Prism Version 6 软件进行统计学分析。所得数据以均值± 标准误（±s）表示。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）检验多组数据间的显著性差异，采用t检验分析两组数据间的显著性差异。以P＜0.05认为具有统计学意义。

3 结 果

3.1 ESMW对游离脂肪酸诱导的肝原代细胞脂质堆积的影响

TG 试剂盒检测结果显示（图1-A），游离脂肪酸刺激后，TG含量显著增加，且中剂量的ESMW可以显著降低细胞内的TG 含量；与该结果一致，BODIPY 荧光染色（图1-B）显示ESMW 有效降低了游离脂肪酸诱导的肝原代细胞中脂质堆积。

Figure 1 Effects of 60% ethanol extract of Si Miao Wan (ESMW) on lipid accumulation in primary mouse hepatocytes induced by free fatty acids (±s, n = 3)A: TG levels determined by TG kits (±s, n = 3); B: BODIPY fluorescence staining##P ＜0.01 vs untreated group; *P ＜0.05 group vs treated with PA + OA only

3.2 ESMW 对Srebp-1、Acc、Fasn mRNA 及蛋白表达的影响

QPCR 的结果显示（图2-A ～2-C），棕榈酸和油酸刺激下，肝细胞中Srebp-1、Acc、FasnmRNA 水平显著上调，而给予ESMW 后，游离脂肪酸诱导的Srebp-1、Acc、FasnmRNA 水平升高得到了抑制。与QPCR 结果一致，Western blot 结果显示（图2-D ～2-G），棕榈酸和油酸作用下，肝细胞中SREBP-1、ACC、FASN 蛋白水平显著上调，ESMW 中、高剂量显著抑制了ACC 及FASN 蛋白表达，中剂量ESMW抑制了SREBP-1 的成熟。以上结果表明，ESMW可以抑制游离脂肪酸诱导的脂质合成。

Figure 2 Effects of ESMW on Srebp-1、Acc and Fasn mRNA and protein expression (±s, n = 3)A-C: Effects of ESMW on the mRNA expression of Srebp-1, Acc and Fasn in cells; D-G: Effects of ESMW on the proteins expression of SREBP-1, ACC and FASN in cells##P ＜0.01, #P ＜0.05 vs untreated group; **P ＜0.01, *P ＜0.05 vs group treated with PA + OA only; ns means no significant difference

3.3 ESMW 对AMPK 的激活作用及对LKB1-AMPK-mTOR信号的影响

图3-A结果表明，在正常生理状态的原代肝细胞中，ESMW 对AMPK 具有显著的激活作用，且呈剂量依赖。

实验结果表明，游离脂肪酸作用下，LKB1 的磷酸化水平受到抑制（图3-C），AMPK 的激活降低（图3-B），而ESMW 给药后，促进了LKB1的磷酸化（图3-C），并显著增加了AMPK 的磷酸化（图3-B）。AMPK 的 激 活 将 抑 制mTOR 信 号。 4EBP1 作 为mTOR 的底物，游离脂肪酸显著增加了4EBP1 的磷酸化（图3-D），表明mTOR 信号激活。ESMW（1 μg/mL）作用后，4EBP1的磷酸化显著降低（图3-D），表明ESMW抑制了mTOR信号。

3.4 ESMW 通过AMPK 抑制HepG2 细胞中的脂质蓄积

AMPKα 敲减后，HepG2 细胞中AMPK 蛋白表达显著降低，表明敲降成功（图4-A，P＜0.01）。随后，用游离脂肪酸对上述敲降细胞进行诱导，考察ESMW 能否抑制饱和脂肪酸诱导的脂质蓄积。实验结果表明，AMPK被敲降后，ESMW对SREBP1的抑制作用及对TG 的抑制作用均被显著减弱（图4-B ～4-D，P＜0.05），证明ESMW 是通过调控AMPK抑制肝细胞中的脂质蓄积。

Figure 3 Effects of ESMW on LKB1-AMPK-mTOR signaling pathway (±s, n = 3)A: Primary mouse hepatocytes were co-incubated with ESMW and the effects of ESMW on AMPK activation were detected by Wester blot; B-D: Primary mouse hepatocytes were co-incubated with palmitate (PA, 150 μmol/L) + Oleinic acid (OA, 150 μmol/L) (1∶1) or PA + OA + ESMW.The effects of ESMW on the phosphorylation of AMPK, LKB1 and 4EBP1 were detected by Western blot##P ＜0.01, #P ＜0.05 vs untreated group;**P ＜0.01, *P ＜0.05 vs group treated with PA + OA only

3.5 ESMW 对高脂喂养小鼠体重、口服葡萄糖耐量的影响

图5-A 结果显示，与对照组相比，模型组体重增长速度较快，给予ESMW 和二甲双胍灌胃后，小鼠体重增加明显受到抑制。如图5-B 和5-C 所示，模型组血糖曲线下面积与对照组相比明显升高。ESMW 组的血糖曲线下面积显著降低，说明ESMW有效改善了高脂诱导的口服糖耐量异常。

3.6 ESMW 对高脂饲喂小鼠血清中生化指标的影响

血浆生化指标结果如表2 所示，与空白组相比，模型组小鼠血清中TG、TC、NEFA 水平显著增加（P＜0.01），表明高脂饲料诱导了小鼠体内脂质代谢异常。ESMW 显著抑制了高脂诱导的血脂相关参数的改变（P＜0.01），改善了脂质代谢。高脂诱导造成小鼠体内高血糖和高血脂，糖毒性和脂毒性共同加剧炎症、氧化应激等发展，最终导致糖尿病、脂肪肝、动脉粥样硬化等糖脂代谢紊乱性疾病的发生发展。本课题组用ELISA 试剂盒检测小鼠血清中炎症因子TNF-α 水平，考察ESMW 对炎症的改善作用。与普通饮食组小鼠相比，高脂饮食明显上调TNF-α 水平，表明高脂诱导了小鼠体内炎症反应的发生。与模型组相比，ESMW 组TNF-α水平下降了21.2%，表明ESMW 能有效改善高脂诱导的小鼠体内炎症反应。

3.7 ESMW 对高脂饲喂小鼠肝脏中脂质蓄积的影响

Figure 4 ESMW inhibited lipid accumulation in HepG2 cells by AMPK activation (±s, n = 3)A: AMPK expression; B: p-SREBP1 expression; C-D: Levels of TG in cells were detected by oil red O and TG kits##P ＜0.01, #P ＜0.05 vs control siRNA group; **P ＜0.01, *P ＜0.05 vs group treated with PA + OA only

Figure 5 Effects of ESMW on body weight (A) and oral glucose tolerance (B, C) in mice fed with high fat diet (±s, n = 8)Control: Normalmice; Model: High fat diet-fed mice; ESMW: High fat diet-fed mice treated with ESMW; MET: High fat diet-fed mice treated with metformin##P ＜0.01 vs control group; **P ＜0.01 vs model group

Table 2 Effects of ESMW on blood biochemical characteristics (±s, n = 8)

Table 2 Effects of ESMW on blood biochemical characteristics (±s, n = 8)

##P ＜0.01 vs control group; **P ＜0.01, *P ＜0.05 vs model group

Group Control Model ESMW MET TG/(mmol/L)0.719 ± 0.0441.209 ± 0.068##0.755 ± 0.051**0.669 ± 0.032**TC/(mmol/L)2.499 ± 0.1133.865 ± 0.033##3.299 ± 0.113**3.374 ± 0.060**NEFA/(mmol/L)0.751 ± 0.0271.167 ± 0.034##0.696 ± 0.036**0.057 ± 0.066**TNF-α/(pg/mL)219.2 ± 13.86462.3 ± 26.91##364.4 ± 22.83*255.3 ± 27.55**

肝脏是脂质代谢的重要器官，前面的实验表明ESMW 能抑制游离脂肪酸诱导的肝脏脂质蓄积。在高脂饲喂动物中，模型组小鼠的肝脏重量显著增加（图6-A），肝组织油红O 染色及TG 试剂盒结果（图6-B，6-E）显示，模型组小鼠肝组织内脂质蓄积严重，ESMW 给药后，动物肝组织的脂质含量明显下降。肝组织HE 染色结果（图6-C）显示，高脂喂养后脂滴空泡增加增大，给药后空泡变少变小，这一结果进一步说明，ESMW 可以改善动物肝脏的脂代谢，减少肝脏脂质蓄积。

Figure 6 Effects of ESMW on lipid accumulation in liver of mice fed high fat diet (±s, n = 8)A: Liver tissues; B: Liver tissues after oil red O staining (400 × ); C: Liver tissues after HE staining (400 × ); D: Weight of liver; E: TG of liver tissues##P ＜0.01 vs control group; **P ＜0.01, *P ＜0.05 vs model group

3.8 ESMW对高脂饲喂小鼠肝脏脂代谢相关基因mRNA表达的影响

脂质代谢包括脂质摄取、脂质合成、脂质转运、脂质的β氧化等多个环节。前面实验中本课题组发现ESMW 能抑制游离脂肪酸诱导的脂质合成相关基因的表达，因此，在高脂饲喂小鼠体内，重点考察了ESMW 对脂质合成相关基因（Srebp-1、Acc、FasnmRNA）及脂质β 氧化相关基因（Pparα、Pgc-1α、Cpt-1α、Fabp-2mRNA）的影响。QPCR 结果显示，模型组小鼠中脂质合成相关基因（Srebp-1、Acc、FasnmRNA）的水平显著上调（图7-A ～7-C），而脂质β 氧化相关基因（Ppar α、Pgc-1α、Cpt-1α、Fabp-2mRNA）水平显著降低（图7-D ～7-G），表明高脂诱导了小鼠体内脂质代谢紊乱，小鼠体内脂质合成及脂质氧化异常。ESMW 显著抑制了高脂诱导的脂质合成相关基因的上升，且促进了脂质氧化相关基因的表达，提示ESMW 能改善高脂诱导的小鼠脂质代谢紊乱。

3.9 ESMW对高脂饲喂小鼠肝脏中脂合成相关蛋白及LKB1-AMPK-mTOR信号的影响

Western blot结果（图8-A）显示，高脂诱导了小鼠肝脏中SREBP-1 前体的大量表达，且成熟型的SREBP-1 水平也显著增强。ESMW 不仅显著抑制了SREBP-1 前体的表达，也抑制了它的成熟。高脂诱导了小鼠肝脏中ACC 的大量表达，并使其磷酸化降低（图8-B），表明高脂诱导了ACC 活性的增加，肝脏中脂质合成增加。ESMW 降低了ACC 的表达并促进了其磷酸化，表明ESMW 能抑制ACC活化，进而改善脂质蓄积。

与体外实验结果一致，高脂抑制了小鼠肝脏中LKB1 的磷酸化（图8-C），也使AMPK 的磷酸化受到抑制（图8-D），同时激活了mTOR 信号（图8-E）。ESMW 显著增强了LKB1 和AMPK 的磷酸化，并抑制了mTOR 信号，表明ESMW 具有调节LKB1-AMPK-mTOR信号的作用。

Figure 7 Effects of ESMW fraction on mRNA expression of lipid metabolism-related genes in liver of mice fed high fat diet (±s, n = 3)A:Srebp-1;B:Acc；C:Fasn;D:Ppar α;E:Pgc-1α;F:Cpt-1α;G:Fabp-2##P ＜0.01, #P ＜0.05 vs control group; **P ＜0.01, *P ＜0.05 vs model group; ns means no significant difference

Figure 8 Effects of ESMW fraction on proteins expression of lipid metabolism-related genes and LKB1-AMPK-mTOR signaling pathway in liver of mice fed high fat diet (±s, n = 3)A:SREBP-1;B:ACC;C: LKB1;D:AMPK;E:4EBP1#P ＜0.05, ##P ＜0.01 vs control group; *P ＜0.05, **P ＜0.01 vs model group

4 讨论

本研究首先以游离脂肪酸诱导小鼠肝原代脂质蓄积细胞模型，TG 试剂盒及BODIPY 荧光染色结果表明ESMW 可有效降低细胞内的脂质堆积。QPCR 及Western blot 结果 表明，ESMW 通 过 调 节SREBP-1、ACC、FASN 抑制游离脂肪酸诱导的脂质合成。在正常生理状态的肝原代细胞中，ESMW剂量依赖性激活AMPK；且在脂质蓄积细胞模型中检测到ESMW 磷酸化LKB1 和AMPK，抑制mTOR 信号。

为了确认AMPK 信号通路在ESMW 调节脂代谢方面的作用，以AMPKα siRNA 敲减HepG2 细胞的AMPKα，TG 试剂盒、油红O 染色实验结果表明AMPKα敲减后，ESMW 改善脂质蓄积的作用减弱；Western blot 实验结果说明AMPKα 敲减后，ESMW对p-SREBP-1蛋白的抑制作用减弱，进一步验证了ESMW 至少部分是通过AMPK 信号发挥脂代谢调节作用。

在高脂饮食诱导的糖脂代谢紊乱模型中，口服葡萄糖耐量和丙酮酸耐量实验结果显示，ESMW可以显著改善高脂饮食动物的葡萄糖耐量和糖异生功能。血清生化指标结果显示，糖脂代谢紊乱模型动物血清TG、TC、NEFA 含量显著增加，而ESMW 给药后可显著改善这些生化指标的异常变化。另外，血清中的炎症因子TNF-α 在ESMW 给药后显著降低，提示该部位还具有抗炎作用。

肝组织油红O染色、HE染色及TG试剂盒结果证实了ESMW 能显著降低肝脏的脂质蓄积。同时，在ESMW 给药后，小鼠肝脏中与脂质合成相关的Srebp-1、Acc、FasnmRNA 的表达水平降低；且与脂肪酸氧化相关的Ppar α、Pgc-1α、Cpt-1α、Fabp-2mRNA的表达水平显著增加，表明ESMW可以显著的降低脂质合成，增加脂质氧化。Western blot 实验结果显示，ESMW显著抑制了脂质合成关键蛋白SREBP-1/ACC 的活化。同时与细胞实验结果一致，ESMW可调节LKB1-AMPK-mTOR的活性。

综上，四妙丸提取物ESMW 具有显著改善糖脂代谢紊乱的作用，其可通过激活AMPK、抑制脂质合成相关酶的表达，抑制脂质合成，进而抑制肝脏中的脂质蓄积。