红细胞膜包裹的聚多巴胺载补骨脂二氢黄酮甲醚纳米粒的制备及其药代动力学

夏晨洁，陈志鹏，李伟东*

（1南京中医药大学药学院；2江苏省中药炮制重点实验室，南京210023）

纳米技术作为“21 世纪的决定性技术”，在药物研发、疾病治疗和诊断及药物递送领域发展迅猛［1］。纳米载体以不同形式与药物分子通过物理包埋、化学键合，构成纳米药物递送系统。因其尺寸、形状、材料等特殊性，可有效改善药物的药代动力学和药效学性能，提高疗效［2］。但物理包埋存在药物稳定性差、载药量低的问题，化学偶联虽然可以提高药物的稳定性和载药量［3］，但合成复杂以及会对断裂后药物的药理作用有一定影响。因此，寻找一种简便、高效的策略提高纳米药物的载药量和稳定性是推动其转化的重要方向。

聚多巴胺（polydopamine，PDA）可以在碱性溶液中由多巴胺发生氧化自聚反应得到［4］，具有良好的生物相容性和可降解性。更为重要的是，由于其表面具有大量的儿茶酚基和胺基，从而显示出较强的吸附能力，具有高载药潜力，适合作为药物载体［5］。此外，为了进一步提高聚多巴胺载药纳米粒在体内的驻留时间，有必要对其进行修饰。细胞膜仿生技术利用仿生载体与机体实现完美兼容，在体内具有长循环、靶向、生物相容性等优势［6-7］。已有文献报道，利用红细胞膜修饰纳米粒可以有效逃逸机体网状内皮系统的吞噬［8-9］，延长其体内循环时间。

补骨脂二氢黄酮甲醚（bavachinin，BVA）是从补骨脂中提取的一种异戊烯基黄酮类化合物，具有抗炎［10］、平喘［11］、抗氧化［12］及抗肿瘤［13］等多种药理作用，具有较为广阔的开发前景。其中，抗肿瘤作用是目前的研究热点，但其口服生物利用度低，无法在体内达到有效的治疗浓度，制约其临床应用，而传统的脂质体等手段无法实现其高载药量负载。为此，本研究利用聚多巴胺的强吸附性，构建补骨脂二氢黄酮甲醚高载药量储库（polydopamine nanoparticles loaded with BVA，BP），进一步利用红细胞膜修饰，构建红细胞膜仿生纳米粒（erythrocyte membrane biomimetic nanoparticles，RBC-BP）（图1），延长其在体内的驻留时间，并初步研究了该递送系统的静脉注射后的小鼠体内药代动力学行为，为利用聚多巴胺纳米粒构建高载药量纳米药物提供有益的借鉴。

Figure 1 Schematic illustration of the preparation process of erythrocyte membrane biomimetic nanoparticles (RBC-BP)RBC: Red blood cell; PDA：Polydopamine；BVA：Bavachinin

1 材 料

1.1 药品与试剂

补骨脂二氢黄酮甲醚（纯度≥98 %，批号：110502，南京世洲生物科技有限公司）；滨蒿内酯（纯度≥99 %，批号：20180203，南京世洲生物科技有限公司）；盐酸多巴胺（美国Sigma-Aldrich 公司）；PBS（北京索莱宝科技有限公司）；甲醇、氨水、乙腈（南京化学试剂有限公司）均为色谱纯；甲酸（德国Merck公司）。

1.2 仪 器

BS-124S 电子天平（德国赛多利斯公司）；1736R 低温高速离心机（GENE 有限公司）；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Zetasizer Nano ZS90 激光粒度仪（英国马尔文公司）；脂质体挤出仪（美国Avanti 公司）；100CX 透射电子显微镜（日本Jeol 公司）；QF-3800 氮气吹干仪（广州科雷纳仪器设备有限公司）；Waters 2695 型高效液相色谱仪（美国Thermo 公司）；5500 MS 系统三重四极杆质谱仪（美国Absciex 公司）。

1.3 动 物

ICR小鼠，雌性，SPF级，体重18 ～22 g（南京中医药大学实验动物中心），动物许可证号：SCXK（浙）2019-0002。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 BVA体外含量测定方法的建立

采用HPLC 法测定BVA 含量。色谱条件：色谱柱为Kromasil-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.01% 甲酸水（75∶25）；检测波长为270 nm；柱温为30 ℃；流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL。BVA 在0.10 ～25.0 μg/mL 范围内线性关系良好，回归方程为y= 46900x+ 76.948，r2= 0.9998；进样精密度RSD 为0.78 %（n= 6）；加样回收率平均值（100.00 ± 0.35）%（n= 6），经验证该方法满足BVA的含量测定要求。

2.2 BP的制备及处方工艺筛选

参照课题组前期制备工艺［14］，利用溶剂置换法制备BP，称取一定量的BVA 溶于乙醇20 mL 中得有机相。随后在搅拌条件下缓慢加入至含PDA的纯水5 mL中，通过室温搅拌孵育负载BVA，旋转蒸发除去乙醇，高速离心10 min，弃去上清液得BP。以吸附率为评价指标，考察PDA 与BVA 的比例、溶液pH、孵育时间和温度等因素对PDA 负载BVA的影响。

2.3 RBC-BP的构建

参照文献报道制备RBC［15］，将制备后的RBC和BP 纳米粒进行混合，调节混合液的pH，常温振摇孵育，高速离心，弃上清液，加入PBS 溶液混匀，得RBC-BP 粗悬液，通过脂质体挤出仪进行多次挤压，制备得粒径均一的RBC-BP 混悬液。为了更好地利用正负电荷作用实现包裹，考察pH 对BP 电位的影响，以PDI 为评价指标考察挤出次数对RBC-BP粒径和均一性的影响。

2.4 RBC-BP的表征

2.4.1 外观形貌观察 用移液枪分别吸取少量的BP、RBC和RBC-BP，滴加到铜网，用磷钨酸负染法染色，自然晾干，将制得的样品通过透射电子显微镜进行分析。

2.4.2 粒径与电位测定 取上述制备所得的RBC、BP 和RBC-BP，用粒度测定仪测定不同样品的粒径和Zeta电位。

2.4.3 吸附率与载药量的测定 称取固定量的BP 或RBC-BP，加入破膜剂（异丙醇-无水乙醇，4∶1），充分吹打并涡旋，高速离心10 min，取上清液，按“2.1”项下色谱条件，HPLC 进样分析，测定BVA 的含量，计算其质量。按下述公式计算吸附率与载药率：吸附率=（载体中BVA 的量/BVA 的加入量）× 100 %，载药率=（载体中BVA 的量/制剂的总量）× 100 %。

2.4.4 释放行为研究 取BVA、BP 和RBC-BP 1 mL置于透析袋内，放入pH 7.4的溶出介质10 mL中，37 ℃振荡，在给定时间点取样，按“2.1”项下色谱条件测定BVA 含量，计算累积释放率，绘制时间-累积释放率曲线。

2.5 小鼠体内药代动力学研究

2.5.1 给药及取样 ICR 小鼠75 只，随机分为3组，实验前12 h禁食，自由饮水。分别尾静脉注射BVA、BP、RBC-BP，给药剂量为40 mg/kg。分别于给药后1、4、8、12、24 h，摘眼球取血约0.5 mL，置预先装有肝素钠的试管中，3000 r/min 离心10 min，分离血浆，-20 ℃条件下保存，备用。

2.5.2 血浆样品处理方法 取小鼠血浆样品90 μL于1.5 mL EP 管中，加入内标液10 μL，振摇混合均匀，再加入乙腈290 μL，涡旋5 min，13000 r/min 离心10 min，取上清液300 μL，真空浓缩后，加甲醇150 μL 复溶，13000 r/min 离心10 min。取上清液用于UHPLC-MS/MS分析。

2.5.3 体内分析方法建立 色谱质谱条件：流动相为0.1% 甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脱：0.01 ～1.0 min，5% ～75%（B）；1.0 ～3.5 min，75%（B），4.5 ～5.0 min，75% ～50%（B）；流速为0.3 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为2 μL。离子源为ESI 源；CUR：35 psi（1 psi = 6.895 kPa）；CAD：8 V；IS：5500 N；TEM：600 ℃；GS1：50 psi；GS2：60 psi。补骨脂二氢黄酮甲醚在血浆中1 ～1250 ng/mL 线性关系良好，回归方程为y= 0.00130x+ 0.00756，r2= 0.9999；方法学考察显示符合生物样品的分析控制要求。

3 结果与讨论

3.1 BP的制备及处方工艺筛选

PDA 与BVA 比例、溶液pH、孵育时间和温度对PDA 负载BVA 的影响结果见图2。如图2-A 所示，当固定PDA 用量时，BVA 在一定范围内均可被负载，吸附率稳定在90% 以上，随着BVA 加入量的增加，质量比例大于1∶0.5 时，PDA 的吸附逐渐趋于饱和，吸附率呈下降趋势。溶液pH 影响研究结果显示（如图2-B 所示），随着pH 增加，吸附率出现先增大后减小的趋势。当pH 为7 时，吸附率最高。随着孵育时间延长，吸附率显著增加，而当孵育时间达6 h 后，吸附率趋于稳定（如图2-C 所示）。孵育温度在10 ～40 ℃时，对吸附率没有明显影响。

综上，最终确定PDA 负载BVA 的处方和工艺参数为：PDA 与BVA 的质量比例为1∶0.5、溶液pH为7、孵育时间为6 h、孵育温度为20 ℃。

Figure 2 Changes in adsorption rate under different ratios of PDA to BVA (A)，pH（B），incubation time（C）and incubation temperature（D）(±s, n = 3)***P ＜0.001

3.2 RBC-BP的构建

溶液pH 对BP 表面电荷影响结果如图3-A 所示，随着pH 的增加，BP 表面电荷逐渐降低，在pH 4 ～7 时，由正电荷转为负电荷。依据细胞膜外侧正电荷内侧负电荷的特性，巧妙地选择BP 在负电荷时进行包覆，实现细胞膜的定向包裹。而当pH为2 时，BP 有聚集变大的趋势，故而本研究选择的溶液pH为4。

挤出次数对RBC-BP 的影响如图3-B 所示，经200 nm 的聚碳酸酯膜挤压，平均粒径控制在200 ～300 nm，随着挤出次数增加，PDI逐渐减小，挤出达3 次以上时，PDI 无明显变化。通过反复挤出可以改善粒径分布，获得均一性良好纳米粒。

Figure 3 BP Zeta potential of different pH（A）and particle size and PDI of RBC-BP with different extrusion times（B）(±s, n = 3)

3.3 RBC-BP的表征

3.3.1 外观形态观察 BP、RBC 和RBC-BP 的透射电镜照片见图4。如图4-A 和4-B 所示，BP 具有良好的球形形貌，RBC 多以碎片存在，部分自发聚集形成不规则的囊泡，图4-C 所示，RBC-BP 呈明显的核壳结构，球形的BP 外周包裹了一层膜结构，说明细胞膜成功包覆。

Figure 4 Transmission electron microscopy of RBC（A），BP（B）and RBC-BP（C）

3.3.2 粒径与电位测定 BP、RBC 和RBC-BP 粒径电位结果见图5。 BP 的粒径为（146.67 ±11.90）nm，由于RBC 部分发生自身聚集形成不规则囊泡，其粒径为（213.67 ± 34.63）nm，与BP 相比，制得的RBC-BP 粒径有所增大为308 nm。RBC-BP 的电位为（4.78 ± 0.76）mV，与RBC 的表面电位（4.89 ± 0.19）mV 相似，间接证明了RBCBP的成功制备。

Figure 5 Particle size and Zeta potential of polydopamine nanoparticles loaded with BVA (BP)，RBC and RBC-BP (±s, n = 3)

3.3.3 载药量及药物释放情况 使用HPLC 法检测BP 和RBC-BP 中BVA 的含量，根据公式计算包封率和载药率，测得BP 吸附率为（92.08 ±0.17）%，载药率为（42.05 ± 2.95）%；RBC-BP 吸附率 为（92.72 ± 3.31）% ，载 药 量 为（30.23 ±4.32）%，吸附率无显著变化，证明包覆过程无药物渗漏。

BVA、BP 和RBC-BP 的累积释药曲线见图6。BVA 溶液表现出快速释放的特征，在1 h 内已经释放近97% 的药量；BP 组在前4 h 释放了约50% 的BVA，之后释放速率减慢，48 h 累积释放量为67 %；RBC-BP在前2 h释放了约20 %的BVA，之后几乎不释放，48 h累积释放量仅为30 %。

综上，PDA 具有较高的载药能力，且在生理环境下较为稳定，进一步用细胞膜包裹后，其稳定性增加。

Figure 6 Cumulative release curves of BVA,BP and RBC-BP in vitro(±s, n = 3)

3.4 药代动力学研究

采用中国药理学会3P97软件包进行房室模型拟合并计算药代动力学参数。 BVA、BP 和RBCBP 药时曲线见图7，其主要药代动力学参数见表1。与BVA 溶液剂相比，BP 和RBC-BP 的AUC0-∞和MRT0-∞分别是BVA 的2.0 倍、2.5 倍和5.4 倍、3.2倍。RBC-BP 的AUC0-∞和MRT0-∞是BP 的2.6 倍 和1.2 倍，表明红细胞膜的包裹能够进一步提高BP的体内驻留时间。

Figure 7 Plasma concentration-time curves of BVA、BP and RBC-BP(±s, n = 5)

Table 1 Comparison of the mean pharmacokinetic parameters of BVA、BP、RBC-BP after a single 40 mg/kg intravenous injection in mouse (±s, n = 5)

Table 1 Comparison of the mean pharmacokinetic parameters of BVA、BP、RBC-BP after a single 40 mg/kg intravenous injection in mouse (±s, n = 5)

**P ＜0.01, ***P ＜0.001 vs BP group

Parameter AUC0-t/(mg/L·h)AUC0-∞/(mg/L·h)MRT0-t /h MRT0-∞/h BVA 9.72 ± 4.269.84 ± 4.253.76 ± 0.513.97 ± 0.55 BP 16.74 ± 7.1020.18 ± 10.795.50 ± 0.7810.00 ± 5.37 RBC-RBC 47.29 ± 10.15***53.18 ± 13.85**7.82 ± 0.27***12.51 ± 0.99

4 结论

近年来，纳米药物取得了长足的进展，但是能够转化应用于临床的却很少，载药量、稳定性以及工业化的可行性一直是限制其发展的主要瓶颈。从中药中提取分离获得多种生理活性良好的化合物，由于溶解度低等问题制约其临床应用。

本研究依据PDA 的强吸附性，实现对BVA 高效负载，制备BVA 的高载药量储库，为进一步制备新型递释系统提供了基础。其次，利用红细胞膜仿生技术进一步修饰载药纳米粒，基于红细胞膜内负外正的电荷特性，巧妙通过调节溶液pH 实现对PDA 的电荷调控，从而实现细胞膜定向包覆纳米粒的目的。成功构建具有长循环特性和高载药量的递送系统，其临床转化有望在将来实现为肿瘤治疗。

PDA 作为一种新型载体，载药方式多样且可调控性强，可以负载多种成分，进一步研究其载药机制，有望将其作为负载多成分的载体，在中药多组分负载具有良好的应用前景，也为中药制剂的现代化研究提供一种新的方向。同时，通过调节细胞膜包覆时的条件，实现细胞膜的定向包裹，最大程度地保留其生理学特点，也为细胞膜修饰递释系统的应用提供了有益的借鉴。