LC-MS/MS法测定人血浆中地高辛的浓度及其在儿童患者中的应用

夏 颖，龙佳奕，代浩然，沈梦元，郭宏丽，胡雅慧，陈 峰*

（1南京医科大学附属儿童医院药学部药学研究中心，南京210008；2中国药科大学础医学与临床药学学院，南京210009；3南京医科大学康达学院，连云港222000）

地高辛（digoxin，DIG）是最早用于心血管治疗的强心苷类药物，其具有正性肌力作用和减慢心率的作用，在儿科中广泛用于心力衰竭及快速型心律失常等［1-2］。然而，地高辛排泄缓慢，易蓄积中毒，药动学、药效学个体差异较大，治疗浓度范围窄，治疗浓度和中毒浓度相近［3］，研究表明，地高辛治疗质量浓度范围为0.5 ～0.9 ng/mL，而质量浓度超过1.2 ng/mL，则易出现中毒［4］。而儿童的器官组织系统发育尚不完善，在药物的吸收、分布、代谢与排泄等方面与成人均有一定的差异，更容易受到药物损害或发生中毒反应，故亟需在儿科中对地高辛进行治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM）［5］。

目前，地高辛的TDM 手段多为免疫法，但存在交叉反应、灵敏度低等缺点，限制其应用［4］。而LCMS/MS法作为小分子化合物检测的“金标准”［6］，具有选择性好、灵敏度高、准确可靠等优势，更适合用于地高辛的TDM。目前，已有多篇文献报道采用LC-MS/MS 法测定地高辛浓度，但其存在前处理复杂、分析时间相对较长等缺点［7-13］，本研究建立了一种简单、快速、灵敏的LC-MS/MS 法，血浆样品用量少，运行时间仅需2 min，能更好地满足地高辛TDM 检测要求，为地高辛的临床个体化用药提供了更加精准的技术手段。

1 材 料

1.1 药品与试剂

地高辛对照品（批号：LRAC3018，纯度：99.0%，美国Sigma-Aldrich 公司）；地高辛-d3 对照品（批号：8-ZCA-105-1，纯度：92.15%，加拿大TLC PharmaChem 公司）；乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚（TBME）均为色谱纯（德国Merck KGaA 公司）；甲酸和醋酸铵（美国Sigma-Aldrich 公司）；纯化水（实验室制备）。

1.2 仪 器

JasperTM高效液相色谱-TripleQuadTM4500MD质谱（新加坡AB Sciex 公司）；超纯水系统（美国Millipore Milli-Q Gradient 公司）；MS205DU 电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；Fresco21低温离心机（美国Thermo Fisher 公司）；AYAN-30L氮气发生器（杭州安研仪器制造股份有限公司）。

2 方 法

2.1 色谱与质谱条件

色谱条件：色谱柱：Kinetex C18（2.1 mm × 50 mm，2.6 μm；Phenomenex）；流动相为含1 mmol/L醋酸铵和1 mmol/L甲酸的水溶液-含1 mmol/L醋酸铵和1 mmol/L 甲酸的乙腈溶液（55∶45）；采用等度洗脱；流速：0.35 mL/min；运行时间：2 min；柱温：35 ℃；自动进样器温度：4 ℃；进样量：5 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），以正离子模式，多重反应监测（MRM）进行离子检测；碰撞气压力（CAD）：7 units；气帘气压力（CUR）：25 psi（1 psi=6.895 kPa）；喷雾气压力（GS1）：60 psi；辅助加热气压力（GS2）：40 psi；离子喷雾电压（IS）：5500 V；离子源温度（TEM）：300 ℃；地高辛和地高辛-d3 的监测离子对分别为m/z798.5 →651.3 和m/z801.6 →654.4；碰撞能量（CE）分别为15 和16 V；去簇电压（DP）分别为30 和7 V；碰撞池入口电压（EP）分别为9 和5 V；碰撞池出口电压（CXP）分别为15和16 V。

2.2 溶液的制备

2.2.1 地高辛储备液和工作溶液的配制 精密称取适量地高辛对照品，经质量校正系数校正后，用纯甲醇将其溶解成质量浓度为1.00 mg/mL 的储备液。再用50% 甲醇水溶液稀释为2.00，4.00，12.0，24.0，120，240，400 ng/mL的标准曲线系列工作液，用50% 甲醇水溶液稀释为2.00，6.00，100，320 ng/mL的质控工作液。

2.2.2 内标地高辛-d3 储备液和工作溶液的配制 取一支地高辛-d3 对照品（规格：1 mg/支），经质量校正系数校正后，用纯甲醇将其溶解成质量浓度为1.00 mg/mL 的储备液。再用纯甲醇稀释为400 ng/mL的内标工作液。

2.2.3 标准曲线及质控样品的配制 将地高辛的工作溶液以1∶19 的比例与空白人血浆混合，得质 量 浓 度 为0.100，0.200，0.600，1.20，6.00，12.0，20.0 ng/mL的系列标准曲线样品和质量浓度为0.100，0.300，5.00，16.0 ng/mL的质控样品。

2.3 血浆样品处理

取血浆样品100 μL，加入含地高辛-d3 的甲醇溶液（400 ng/mL）30.0 μL，涡旋3 min，加入TBME 400 μL，涡旋10 min，在4 ℃条件下以12000 r/min离心10 min，取上清液300 μL，氮气吹干后用50%甲醇水溶液80 μL复溶，进LC-MS/MS定量分析。

2.4 血药浓度测定

一名先天性心脏病患儿（11 岁，女，体重22.5 kg）长期口服地高辛片0.16 mg/d，分两次口服，其血药浓度已达稳态。于次日清晨给药前采集其静脉血约3 mL，置于EDTA K2抗凝管中，全血离心后取上清血浆，保存于-20 ℃冰箱待测。

3 结 果

3.1 选择性

制备6个不同来源的双空白样品，只含内标不含待测物的零点样品，不含内标的定量上限样品，按“2.3”项操作，进样分析。结果表明血浆中内源性物质不干扰待测物的测定，内标和待测物间无相互干扰，见图1。

3.2 线性范围和定量下限

将地高辛标准曲线样品按“2.3”项操作，进LC-MS/MS 分析。采用回归模型y= ax+ b（x：待测物的质量浓度；y：待测物与内标峰面积的比值），以1/x2的权重因子进行线性回归，得到典型标准曲线方程：y= 6.36x- 3.15e-5（r= 0.9988），结果表明，地高辛在0.100 ～20.0 ng/mL 范围内，线性关系良好。

3.3 精密度与准确度

按“2.2.3”项下制备4 个不同质量浓度水平（0.100，0.300，5.00，16.0 ng/mL）、每个质量浓度水平6个重复的质控样品，考察批内准确度和精密度；通过3个连续的考察准确度和精密度的分析批（于不同天处理）来考察批间准确度和精密度。按“2.3”项操作，进样分析。结果见表1。表明该方法准确度和精密度良好，符合生物样品分析要求。

3.4 基质效应与提取回收率

按“2.2.3”项下制备3 个质量浓度水平（0.300，5.00，16.0 ng/mL）的质控样品，按“2.3”项操作，进样分析，得地高辛及地高辛-d3 的峰面积分别为A1和A2；将空白基质按“2.3”项操作后，加入相应工作溶液，使最终进样浓度与上述质控样品浓度一致，进样分析，得地高辛及地高辛-d3 的峰面积分别为B1和B2；将相应工作溶液直接进样，使其质量浓度与上述质控样品浓度一致，得地高辛及地高辛-d3 的峰面积分别为C1和C2。地高辛及其内标的提取回收率分别为A1/B1× 100%、A2/B2×100%，基质效应分别为B1/C1× 100%、B2/C2× 100%，结果见表2，表明该方法提取回收率良好，无基质效应影响。

Table 1 Intra- and inter-batch precision and accuracy of digoxin in human plasma (±s)

RSD:Relative standard deviation; RE:Relative error

c/(ng/mL)0.1000.3005.0016.0 Intra-batch (n = 6)cMeasured/(ng/mL)0.102 ± 0.0080.319 ± 0.0145.30 ± 0.1116.8 ± 0.8 Precision/(RSD, %)7.84.42.14.8 Accuracy/(RE, %)2.06.36.05.0 Inter-batch (n = 18)cMeasured/(ng/mL)0.108 ± 0.0100.301 ± 0.0245.38 ± 0.1716.7 ± 1.5 Precision/(RSD, %)9.38.03.29.0 Accuracy/(RE, %)8.00.37.64.4

3.5 稳定性考察

按“2.2.3”项下配制低、中、高3个质量浓度水平（0.300，5.00，16.0 ng/mL）的质控样品，分别考察室温放置12.6 h、-20 ℃冻融循环5 次、-20 ℃冷冻56 d 和处理后样品在4 ℃自动进样器放置4 d 2 h 的稳定性（结果见表3），表明地高辛在各考察条件下稳定性良好。

Table 2 Matrix effect and recovery of digoxin in human plasma (xˉ±s, n = 6)

Table 3 Stability of digoxin in human plasma (±s, n = 3)

Table 3 Stability of digoxin in human plasma (±s, n = 3)

Storage conditions Room temperature stability (25 °C, 12.6 h)Freeze-thaw stability (-20 °C, five cycles)Long term stability (-20 °C, 56 d)Autosampler stability (4 °C, 4 d 2 h)c/(ng/mL)0.30016.00.30016.00.30016.00.30016.0 cMeasured/(ng/mL)0.298 ± 0.01217.0 ± 0.40.288 ± 0.02116.8 ± 0.20.341 ± 0.01718.3 ± 0.70.330 ± 0.01716.8 ± 0.7 RE/%-0.76.3-4.05.013.714.410.05.0 RSD/%4.02.47.31.25.03.85.24.2

3.6 血药浓度测定结果

该患儿血浆样品按“2.3”项下处理后，用LCMS/MS 方法测定其体内地高辛的浓度，测得其稳态谷质量浓度为1.73 ng/mL，色谱图见图2。

Figure 2 Chromatograms of a plasma sample from a Chinese pediatric subject before next administration of DIG (A: DIG;B: DIG-d3)

4 讨论

4.1 监测离子对的选择

质谱检测时，由于地高辛等强心苷类化合物对铵离子和钠离子等有很强的亲和力，故以正离子模式扫描时很容易形成它们的加合离子［11］。文献中采用的母离子多为［M + NH4］+，另外也有文献采用［M + Na］+、［M + Li］+、［M + HCOO］-、［M - H］-等［8-11，14］，其母离子产生的不同加合离子的响应与扫描离子时的实验条件密切相关［9］。本研究中，母离子扫描时出现［M + NH4］+、［M + K］+和［M + Li］+，［M + K］+峰响应太低，故不进行后续分析。有文献选用［M + Li］+峰，定量下限可达0.160 ng/mL［9］，本研究尝试选用［M + Li］+峰，用简单的蛋白沉淀法进行样品前处理，比较了流动相中含0.05 mmol/L、0.5 mmol/L 和5 mmol/L 甲酸锂时地高辛的响应，发现无法达到定量下限要求，且检测器出现了较严重的老化。后续方法开发中，发现［M + NH4］+和［M + Li］+峰响应类似，由于若采用［M + Li］+峰，需在流动相中添加甲酸锂以形成稳定的加合离子，而不挥发的锂盐会使检测器老化，故最终选用［M + NH4］+峰。地高辛和地高辛-d3 的监测离子对分别为m/z798.5 →651.3 和m/z801.6 →654.4。

此外，与之前的研究相比，本方法的选择性好、灵敏度高。Kirby 等［8］方法的定量下限可达0.05 ng/mL，但其选用的是选择离子监测模式（SIM），选择性不及本研究中的MRM 模式，且其前处理相对复杂。Hirabayashi 等［11］方法的线性范围为0.100 ～10.0 ng/mL，虽其定量下限与本方法相同，但本方法线性范围更宽，且前处理相对简单。其他研究中的定量下限均较本方法高，前处理也较复杂［9-10，14］。

4.2 流动相的选择

本研究比较了有机相为甲醇和乙腈时的色谱峰形和响应，发现其他实验条件相同时，以乙腈为有机相，地高辛响应更高，基线更低，且保留时间较短，分析时间短，见图3，故选择乙腈为有机相。本研究比较了不同浓度甲酸（0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L）和不同浓度醋酸铵（0.1、0.2、0.5、1、2 mmol/L）对地高辛检测的影响，发现流动相含1 mmol/L 醋酸铵和1 mmol/L 甲酸时，地高辛响应最高，且无其他干扰，故最终流动相为含1 mmol/L醋酸铵和1 mmol/L甲酸的水溶液-含1 mmol/L醋酸铵和1 mmol/L甲酸的乙腈溶液。

Figure 3 Chromatograms of 10.0 ng/mL DIG working solution compared with different mobile phase B (A: ACN; B: MeOH)ACN：Acetonitrile

4.3 干扰问题的解决

本研究发现以有机相比例为30%、35%、50%进行等度洗脱或梯度洗脱，内标通道存在干扰峰，而采用有机相比例为45% 的等度洗脱，干扰问题解决，故最终选用有机相比例为45%的等度洗脱。

本研究采用的是氘代内标，可有效避免由于仪器波动等导致的检测偏差，并可避免基质效应等影响。然而，方法开发中发现待测物对内标存在干扰，且无法通过更换离子通道来解决，最终采用提高内标工作溶液质量浓度至400 ng/mL，使干扰峰响应仅为内标响应的0.2%，即待测物对内标的干扰可忽略不计，不影响检测。

4.4 样品前处理的优化

文献中均采用液液萃取法（LLE）或固相萃取法（SPE）进行血浆样品处理［8-11，14］，但这些方法存在繁琐、成本较高、毒性较大等缺点。本研究拟先采用蛋白沉淀法（PPT）进行样品处理，发现无法满足定量下限检测要求，故选用LLE。本研究比较了TBME、乙酸乙酯（ETOAc）、TBME-ETOAc（3∶1）、环己烷的提取效率，发现以TBME 为提取溶剂，地高辛响应最高，提取回收率良好且无基质效应，故最终选用TBME为提取溶剂。

5 结论

本研究建立了一种前处理相对简单、灵敏度高、准确度好的LC-MS/MS 法，用于测定人血浆中地高辛的浓度，该方法定量下限低至0.100 ng/mL，可满足地高辛TDM 检测要求，检测时间短，可在2 min 内完成单个样本检测。经方法学验证，该方法选择性好，准确度和精密度好，各浓度水平提取回收率平行，稳定性良好，无基质效应和残留影响，可用于生物样本分析。并且，该方法已成功用于地高辛治疗的先天性心脏病患儿的临床样本检测，为临床合理用药提供了可靠依据。